Resumen de Quantifying RNA and DNA in planktonic organisms with SYBR Green II and nucleases: Part B. Quantification in natural samples

Elisa Berdalet, Cristina Roldán, María Pilar Olivar

• español

  En este trabajo se han desarrollado los protocolos de extracción de ARN y ADN en extractos no purificados de muestras naturales de microplancton. La metodología es compatible con el ensayo fluorimétrico para ARN y ADN desarrollado por Berdalet et al. (2005). La extracción de los ácidos nucleicos se realiza combinando una rotura celular mecánica (mediante un homogeneizador manual de tejidos) con una extracción química (con 0.5% de sarcosina y 0.5 mM EDTA en tampón Tris 5 mM a pH 8). Este nuevo procedimiento de extracción y ensayo se usó para estimar los cocientes ARN/ADN en larvas de peces y comunidades naturales de microplancton mantenidos en el laboratorio bajo diferentes condiciones nutricionales. En los dos experimentos los cocientes ARN/ADN estuvieron relacionados con los nutrientes disponibles para los organismos. El nivel de sensibilidad del método fue establecido experimentalmente a aproximadamente 40 ng de ARN y 10 ng de DNA en ensayos de 1 ml, lo que corresponde a un requerimiento mínimo de biomasa de aproximadamente 400 ng ml-1 de proteína o 3 µg ml-1 de peso seco. La precisión, estimada en distintos pasos del método, tuvo un coeficiente de variación global del 10%. Esta nueva aproximación proporciona cocientes ARN/ADN comparables a las obtenidas con bromuro de etidio.

• English

  Extraction procedures for RNA and DNA in crude extracts of natural microplankton samples are developed. The methodology is compatible with the fluorometric assay of RNA and DNA developed by Berdalet et al. (2005). Mechanical cell disruption using a manual tissue grinder is combined with chemical extraction using 0.5% sarcosine and 0.5 mM EDTA in 5 mM Tris, pH 8.0, to release the nucleic acid. The new extraction and assay procedure is used to estimate the RNA/DNA ratios of fish larvae and natural microplankton communities maintained in the laboratory under different nutritional conditions. In the two experiments, the RNA/DNA ratios were related to the nutrient availability of the organisms. The level of sensitivity of the method is experimentally set at ca. 40 ng of RNA and 10 ng DNA in the 1 ml assay, which corresponds to a minimum biomass requirement of ca. 400 ng ml-1 protein or 3 µg ml-1 dry weight. The precision, estimated at different steps of the procedure, had an overall coefficient of variation of =10%. The new approach provides RNA/DNA ratios comparable with those obtained with ethidium bromide.