Resumen de Identificación de las proteínas secretadas por el hongo Ustilago maydis (DeCandole) Corda (Basidiomiceto) cultivado en condiciones in Vitro

Andrés Adolfo Estrada Luna, Alicia Chagolla López, Hilda Eréndira Ramos Aboites, Angelina Guerrero Ambriz, José Ruiz Herrera

• español

  Introducción: Ustilago maydis es un hongo basidiomiceto que infecta al maíz y teozintle produciendo una enfermedad conocida como carbón común o huitlacoche. Actualmente no existen reportes acerca del secretoma del hongo cultivado bajo condiciones in vitro. Un estudio de esta naturaleza permitiría caracterizar los genes involucrados en varios procesos importantes, entre los que se tienen aquellos relacionados con la nutrición, la patogenicidad y la diferenciación del hongo. El objetivo de esta investigación fue identificar las proteínas secretadas al medio de cultivo por las formas de levadura o micelio de este hongo cultivado en dos condiciones de pH.

  Método: Se generaron las formas de micelio o levadura de Ustilago maydis (cepa FB2.a2b2) a través del cultivo en medios mínimos con pH 3 y 7 respectivamente y se determinó su cinética de crecimiento. Las proteínas secretadas al medio se concentraron en una columna de fase reversa Sep-Pak Plus C18 y se eluyeron con una solución de acetonitrilo (60 %) + ácido trifluoroacético (0.1 %), seguida de su liofilización parcial, y precipitación con ácido tricloroacético-acetona.

  Posteriormente las muestras fueron sometidas a electroforesis en poliacrilamida (SDS-PAGE) y los geles teñidos con azul de Coomassie. Las bandas de proteína se cortaron del gel y se digirieron con tripsina. Las mezclas de péptidos fueron inyectados para su análisis en un espectrómetro de masas y el espectro MS/MS obtenido fue procesado en Masslynx 4.0 antes de someterlo al programa MASCOT (Matrix Science) para realizar las búsquedas no-redundantes en la base de datos del National Center for Biotechnology Information. Resultados: El crecimiento de U. maydis a pH 7 fue mayor que a pH 3 (D.O. a 600 nm= 1.35 y 0.85, respectivamente) a las 30 h de incubación. El proceso dimórfico de levadura a micelio a pH 3 se inició a las 8 h después de iniciados los cultivos. A las 30 h de cultivo se observó que el 100 % de las células tenían una morfología micelial. A este tiempo, se colectó el sobrenadante y se sometió al proceso descrito anteriormente, obteniéndose de manera reproducible 8 bandas de proteína del medio mínimo del cultivo a pH 7 y 2 del medio mínimo del cultivo de pH 3. Las proteínas se analizaron, pero solo fue posible identificar 5, todas ellas provenientes del medio de pH 7, cuyas masas teóricas oscilan entre 31 y 68 kDa y presentan valores de punto isoeléctrico calculados en un rango de 4.72 a 10.13. Cuatro de las 5 proteínas fueron identificadas como de secreción de U. maydis. Tres de las 5 proteínas son de función desconocida, una está relacionada con el precursor de la spherulin 4 y la última parece ser una proteína GPI (glycosyl phophotidylinositol ) relacionada con una glucanasa.

  Discusión o Conclusión: Los resultados aquí presentados son los primeros datos descritos de proteínas secretadas al medio en condiciones in vitro por la forma de levadura de U. maydis Con este trabajo se establecieron las bases para el estudio posterior del secretoma del hongo.

• English

  Introduction: Ustilago maydis is a fungus included in the group of Bacidiomycete that host maize and teocinte plants producing a disease known as common smut or huitlacoche. Today, there are no reports regarding the secretome of this organism grown under in vitro conditions.

  This information might be useful to characterize the genes involved in several important processes such as those related to nutrition, pathogenicity and fungus diferentiation. The main objective of this study were to identify the proteins differentially expressed and secreted into the culture media by both the sporidia and mycelium forms grown in two conditions of pH and analyzed through the mapping in SDS-PAGE geles.

  Methods: We initially generated the two morphological forms (sporidia and mycelium) of Ustilago maydis (strain FB2.a2b2) through its culture in minimal media with adjusted pH of 7 and 3, respectively, and the growth kinetics was determined. The secreted proteins to the culture medium were concentrated in a Sep-Pak Plus C18 and eluted with a solution of acetonitrile (60 %) + trifluoroacetic acid (0.1 %) followed by a partial liophilization and precipitation with trichloroacetic acid-acetone solution. After this step, the protein samples were subjected to a polyacrilamide (SDS-PAGE) electophoresis and stained with Coomassie blue for mapping. The protein bands obtained were cut from the gels and digested with tripsin. Then, the mix of peptide samples were injected in a mass spectrometer for analysis and the obtained MS/MS spectra were then analyzed with Masslynx 4.0 before being subjected to MASCOT (Matrix Science) to perform non-redundant searches on the National Center for Biotechnology Information data base.

  Results: After 30 h of inoculation, the growth kinetics of U. maydis cultivated at pH 7 was consistently higher compared to pH 3 (O.D. at 600 nm= 1.35 and 0.85, respectively). The process of dimorphism from sporidia to mycelia at pH 3 began 8 hours after inoculation. Thirty hours after inoculation, we observed that 100 % of cells had differentiated into mycelia. At this time, the supernatant was collected and processed as previously described, obtaining 8 reproducible bands of proteins from the minimal medium at pH 7 and 2 from the minimal medium of pH 3. All proteins were analyzed, however, only 5 from media at pH 7 were identified and their theoretical mass ranged between 31 to 68 kDa showing calculated isoelectrical points between 4.72 y 10.13.

  Four out of the five proteins were identified as secretion proteins of U. maydis. Three of the five proteins have an unknown function, one of them is related to the Spherulin 4 Precursor, and the remaining one seems to be a GPI (glycosyl phophotidylinositol ) related to Glucanase.

  Discussion or Conclusion: Our results are the first set of data describing secreted proteins to the media under conditions in vitro by the sporidial form of U. maydis. With this research we established the bases to study the secretome of the fungus.