Resumen de Producción de esferoplastos a partir de esporanglos del mildeo velloso de la rosa comercial

Angélica Aguilera Gómez, Juan José Filgueira Duarte

• español

  Para el presente estudio, se estandarizó una técnica para el cultivo bajo condiciones de laboratorio del parasito biotrofo (Peronospora sparsa Berkeley) ,en cámara húmeda; también realizo cultivo in vitro de la variedad de rosa Charlotte, con el fin de realizar los ensayos de infección sobre este material vegetal;

  se evaluaron mezclas enzimáticas y concentraciones de estas, para realizar la digestión de la pared celular de los esporangios de mildeo velloso y se encontró que al cabo de 5 horas se obtenían esferoplastos con la mezcla enzimática de Fluka (enzimas líticas de Trichoderma harzianum), 2 mg/ml y Driselasa 3 mg/ml, también se evaluaron diferentes buffers hasta conseguir aquel que garantizara el equilibrio osmótico de los esferoplastos durante su producción y manipulación en los ensayos de infección. Se encontró que el buffer KC (KCl 0.64M, CaCl2 0.2 M) mantuvo los esferoplastos osmóticamente estables durante un periodo de hasta 24 horas. Luego de 3 lavados y re-suspensión en buffer MTC-10 (1M manitol, 10mM tris, pH 7.5), con los esferoplastos obtenidos se realizó un seguimiento del proceso infectivo tanto en plántulas producidas in vitro, como sobre foliolos de campo de rosa variedad Charlotte, utilizando técnicas de microscopia óptica y se observó que los esferoplastos además de conservar su capacidad infectiva, esta parecía ser más agresiva que la observada típicamente en la infección con esporangios, por lo tanto, se realizaron pruebas comparativas infectando al mismo tiempo, los mismos tipos de tejidos tanto con esferoplastos como con esporangios y se pudo llegar a la conclusión que el desarrollo de la enfermedad del mildeo velloso de la rosa, es más rápido y expansivo en la infección con esferoplastos que con esporangios normales.

  Por último, se realizo un seguimiento del proceso infectivo en plantas completas de la variedad de rosa Charlotte y se observo la aparición de síntomas típicos de la enfermedad en la mitad del tiempo que normalmente se observa en plantas infectadas con mildeo velloso en campo.

• English

  For this study, it was standardized a technique to cultivated under laboratory conditions the biotrophic parasite Peronospora sparsa Berkeley. An in vitro growing media for rose Charlotte varietyh was also standardized.

  Infection assays were made on this vegetable material, evaluating enzymatic mixtures and concentrations, in order to digest the cellular wall of downy mildew sporangia: It was found that after 5 hours the spheroplasts were obtained with the enzymatic mixture Fluka (litic enzymes of Trichoderma harzianum) 2mg/ml and Driselase 3 mg/ml. Buffers were also evaluated with the purpose to find one of them that could guarantee the osmotic equilibrium of these spheroplasts during their production and manipulation: It was found that the buffer KC (KCl 0.64M, CaCl2 0.2 M), has the capability to maintain the spheroplast of P. sparsa under osmotic equilibrium during a period of 24 hours. After a re-suspension in buffer MTC-10 (1M Manitol, 10mM Tris, pH 7.5), with these spheroplasts it was done an optic microsope follow up of the infective process on both plants that were produced in vitro and rose leafs that were recollected in field. In addition to keep their infective capabilities, spheroplasts also look more aggressive than the infective capability observed typically in infection with sporangia, as a consequence, there were made comparative proofs infecting at the same time, the same type of tissues not only with spheroplasts but also with sporangia and it was concluded that the development of the disease downy mildew is more faster and expansive in the infection caused by spheroplasts than the infection caused by sporangia. Finally a follow up of the infection was made in complete plants of Charlotte variety that were recollected in field, and it was observed that the appearance of typical symptoms of the disease were manifested at the half of time that it appear normally on infected plants in field.