Aislamiento y purificación del virus X de la papa y clonación del gen de su cubierta proteica

• Autores: L. Duplat, O. Acosta, J. Peñaranda, M. Caro
• Localización: Revista Colombiana de Biotecnología, ISSN 0123-3475, ISSN-e 1909-8758, Vol. 3, Nº. 1, 2001, págs. 53-62
• Idioma: español
• Títulos paralelos:
  • Potato virus X isolation and purification and coat protein gene cloning
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• Resumen
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    El objetivo principal de este trabajo fue obtener clones del gen que codifica la cubierta proteica (CP) del virus X de la papa (PVX). Para lograrlo se estudió un aislamiento colombiano del PVX obtenido de muestras de plantas de papa recolectadas en el páramo de San Jorge (CORPOICA). Después de la inoculación sobre Datura stramonium, se tomó una lesión local producida sobre este hospedero y se inocul ó sobre Nicotiana tabacum, de cuyo tejido se purificó el PVX. El RNA genómico extraído de las partículas virales purificadas presentó un tamaño de aproximadamente 6 Kb. La síntesis del cDNA, utilizando el primer 4DT/KPN, se evidenció mediante la incorporación de Digoxigenina. La amplificación por PCR del gen CP, a partir del cDNA sintetizado, se realizó utilizando el primer OX6 junto con el primer LK/pn, complementario a la secuencia del extremo 5´ del primer 4DT/KPN. El producto de la amplificación presentó el tamaño esperado de aproximadamente 870 pb, en adición a otros productos de 600-123 pb. Estos fragmentos amplificados fueron clonados en el plásmido pMOSBlue. Los recombinantes fueron analizados en “minipreps”, digiriendo el plásmido con Sma I y Hind III o utilizando el método de amplificación con PCR directamente de la colonia. Las colonias transformadas con el inserto apropiado fueron almacenadas en glicerol a -70 °C.

  • English

    In this work we describe the construction of potato virus X coat protein (PVX-CP) gene clones from a Colombian isolate. Virus was isolated from field potato plants cultured at páramo de San Jorge. PVX particles were purified from Nicotiana tabacum leaves infected with a local lesion taken from Datura stramonium plants. The genomic RNA present in the virus particles consisted of a single species of about 6 Kb. cDNA synthesis representing genomic RNA was followed by Digoxigenin incorporation after priming with oligonucleotide 4DT/KPN. PCR amplification of CP gene sequence was made by using oligonucleotides OX6 and L/Kpn. An expected fragment of 870 bp, besides some 600-123 bp fragments, was obtained after PCR. The blunt-ended fragments were clonned into the PCR cloning pMOSblue plasmid. The insert size of the selected recombinant cDNA clones was determined by restriction analysis of the plasmidDNAwith Sma I and Hind III enzymes. Positive clones were also screened by direct colony PCR screening. The selected recombinant cDNA clones were stored in glycerol at .70 °C.