Assessment of DNA extraction methods from GMO analysis for grain monitoring in Mexico: Part II: quantification by real-time PCR

• Autores: Abraham I. Acatzi-Silva, Amanda Galvez Mariscal, Javier Plasencia, Maricarmen Quirasco
• Localización: Agrociencia, ISSN 2521-9766, ISSN-e 1405-3195, Vol. 48, Nº. 1, 2014, págs. 35-52
• Idioma: inglés
• Títulos paralelos:
  • Evaluación de métodos de extracción de ADN para el análisis de OGM en el monitoreo de granos en México: Parte II: cuantificación por PCR en tiempo real
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• Resumen
  • español

    Por su especificidad y alta capacidad de procesamiento, los métodos basados en PCR en tiempo real son adecuados para el monitoreo de los organismos genéticamente modificados (GM) en el campo o en el comercio de granos, para cumplir con las regulaciones federales sobre bioseguridad. En la primera parte de este estudio, el ADN extraído de diferentes tejidos de maíz (Zea mays L.) mediante varios protocolos de purificación comerciales disponibles en México, se evaluó en términos de calidad como sustrato molde para PCR en punto final. En esta segunda parte, las preparaciones de ADN obtenidas de granos, por medio de los mismos protocolos comerciales, se probaron en PCR cuantitativa (qPCR) usando las técnicas TaqMan y SYBR Green. El rango dinámico lineal, la eficiencia de amplificación y la precisión se evaluaron usando criterios qPCR recomendados para validación. Los resultados mostraron que la complejidad química de los tejidos vegetales, como los granos, requiere un protocolo de purificación eficaz para la cuantificación consistente y confiable por PCR. La relación A260/280 y el análisis del ADN en geles de agarosa se recomiendan como criterios preliminares -pero no exclusivos- de la calidad del ADN porque la capacidad de amplificación del ADN no se evidencia con estos procedimientos. Dos de los métodos probados produjeron ADN de buena calidad como lo revela el análisis de rango dinámico lineal. El tercer método analizado dio resultados inexactos debido a la presencia de inhibidores de la PCR endógenos de los granos que impidieron una cuantificación adecuada del ADN. Como conclusión, la química TaqMan mostró ser más susceptible a la presencia de impurezas que SYBR Green, a pesar de que la amplificación podría lograrse con esta última, la cuantificación puede ser inexacta. Las membranas de unión al ADN de sílica generaron las preparaciones de ADN más adecuadas para la cuantificación por PCR de los granos de maíz GM.

  • English

    Because of their specificity and high throughput, real-time PCR-based methods are suitable for the monitoring of genetically modified (GM) organisms at field level or in the grain trade, in order to comply with federal regulations on biosafety. In the first part of this study, DNA extracted from different maize (Zea mays L.) tissues using several commercial purification protocols available in Mexico were evaluated in terms of DNA quality as substrates for end-point PCR. In this second part, DNA preparations obtained from grain, by means of the same commercial protocols, were tested in quantitative PCR (qPCR), using TaqMan and SYBR Green protocols. Linear dynamic range, amplification efficiency and method accuracy were assessed using recommended qPCR criteria for validation purposes. Results showed that the chemical complexity of plant tissues, such as grains, require an efficient purification protocol for consistent and reliable PCR quantification. The ratio A260/280 and DNA visualization in agarose gels are recommended as preliminary -but not exclusive- criteria of DNA quality because DNA amplification capability is not evinced with these procedures. Two of the methods tested yielded good-quality DNA as revealed by the linear dynamic range analysis. The third method analyzed rendered inaccurate results due to the presence of grain endogenous PCR inhibitors that did not allow a proper DNA quantification. As conclusion, TaqMan chemistry showed to be more sensitive to the presence of impurities than SYBR Green, even though amplification could be achieved in the latter, quantification may not be accurate. Silica DNA-binding membranes yield the most suitable DNA preparations for PCR quantification of GM maize grains.