Resumen de Monitorització de malaltia residual mínima en el neuroblastoma mitjançant dilucions seriades amb RT-Nested-PCR

Andreu Parareda, Anna Llort Sales, Jaume Reventós Puigjaner, José Sánchez de Toledo Codina, Soledad Gallego Melcón

• español

  Fundamento.

  El neuroblastoma es el tumor sólido extracraneal más frecuente en edad pediátrica. Las células tumorales sintetizan catecolaminas y la expresión del primer enzima de esta vía de síntesis –la tirosina hidroxilasa (TH)– se utiliza como marcador de células tumorales circulantes. Se ha constatado con frecuencia la presencia de células neuroblásticas circulantes en sangre periférica y médula ósea de pacientes en estadios avanzados, pero su detección no necesariamente se correlaciona con la evolución clínica de los pacientes. La cuantificación de la enfermedad residual mínima podría relacionarse mejor con el pronóstico de estos pacientes.

  Objetivo.

  Utilidad de la técnica RT-Nested-PCR para el estudio de la enfermedad residual mínima en el neuroblastoma.

  Método.

  Se utiliza un ensayo de retrotranscripción y dos PCR consecutivas con diferentes “primers” (nested-PCR), con diluciones seriadas donde el RNA problema es logarítmicamente menor en cada una de las diluciones. Se controlan 5 pacientes afectos de neuroblastoma en estadios avanzados después de la finalización del tratamiento, en los que se había demostrado previamente la presencia de células de neuroblastoma circulantes. Se analizan 20 muestras de sangre periférica y 13 de médula ósea. Se utilizaron 30 muestras de sangre periférica de donantes sanos como control negativo y la linea celular IMR-32 como control positivo. La sensibilidad del ensayo se estableció en 1 célula por cada 10 millones de células circulantes.

  Resultados.

  Fueron detectadas células de neuroblastoma circulantes en un 65% de muestras de sangre periférica y en un 46% de médula ósea de pacientes en seguimiento diagnosticados de neuroblastoma en estadios avanzados. También se detectaron en un porcentaje del 33% de muestras de sangre periférica de donantes sanos.

  Las bandas positivas fueron secuenciadas y coincidieron con el mRNA de TH humana. De los 5 pacientes sometidos a monitorización de la expresión de TH, en 2 hubo un incremento de enfermedad residual sin eventualidades clínicas, en 2 hubo un aumento de enfermedad residual y recaída clínica (a los 8 y 14 meses) y en otro se mantuvieron estables tanto la enfermedad residual como la clínica.

  Conclusiones.

  La detección simple de expresión de TH con técnicas de alta sensibilidad, como la utilizada en el presente trabajo, es frecuente. La cuantificación de enfermedad residual nos permite diferenciar unos pacientes con enfermedad residual estable de otros con enfermedad residual progresiva. La detección de positividad de expresión de TH en muestras control hace que nos planteemos la posibilidad de expresión ilegítima, el estudio de la cual mediante otras técnicas podría diferenciarla de la que presentan las células tumorales.

• català

  Fonament.

  El neuroblastoma és el tumor sòlid extracranial més freqüent en edat pediàtrica. Les cèl·lules tumorals sintetitzen catecolamines i l’expressió del primer enzim d’aquesta via de síntesi -la tirosina hidroxilasa (TH)- s’utilitza com a marcador de cèl·lules tumorals circulants.

  S’ha constatat freqüentment la presència de cèl·lules neuroblàstiques circulants en sang perifèrica i moll d’os de pacients en estadis avançats, però la seva detecció no necessàriament es correlaciona amb l’evolució clínica dels pacients. La quantificació de la malaltia residual mínima podria relacionar-se millor amb el pronòstic d’aquests pacients.

  Objectiu.

  Analitzar la utilitat de la tècnica de RT-Nested-PCR per a l’estudi de la malaltia residual mínima en el neuroblastoma.

  Mètode.

  S’utilitza un assaig de retrotranscripció i dues PCR consecutives amb diferents “primers” (nested-PCR), amb dilucions seriades on l’RNA problema és logarítmicament menor en cada una de les dilucions. Es controlen 5 pacients afectes de neuroblastoma en estadis avançats després de la finalització del tractament, en els quals s’havia demostrat prèviament la presència de cèl·lules de neuroblastoma circulants. S’analitzen 20 mostres de sang perifèrica i 13 de moll d’os. Es van utilitzar mostres de sang perifèrica de 30 donants sans com a control negatiu i la línia cel·lular IMR-32 com a control positiu. La sensibilitat de l’assaig fou establerta en 1 cèl·lula per cada 10 milions de cèl·lules mononucleades.

  Resultats.

  Foren detectades cèl·lules de neuroblastoma circulants en un 65% de mostres de sang perifèrica i en un 46% de moll d’os de pacients en seguiment diagnosticats de neuroblastoma en estadis avançats. També van detectar-se en un percentatge del 33% de mostres de sang perifèrica de donants sans. Les bandes positives van ser seqüenciades i van ser coincidents amb l’mRNA de TH humana. Dels 5 dels pacients sotmesos a monitorització d’expressió de TH, en 2 hi va haver un augment de malaltia residual mínima sense eventualitats clíniques, en 2 hi va haver augment de malaltia residual mínima i recaiguda (als 8 i 14 mesos) i un altre es va mantir estable tant en malaltia residual mínima com clínicament.

  Conclusions.

  La detecció simple d’expressió de TH amb tècniques d’alta sensibilitat, com la usada en aquest treball, és freqüent. La quantificació de malaltia residual mínima ens permet diferenciar uns pacients amb malaltia residual estable d’altres amb malaltia residual progressiva. La detecció de positivitat d’expressió de TH en mostres control ens fa plantejar la possibilitat d’expressió il·legítima, l’estudi de la qual mitjançant altres tècniques podria diferenciar-la de la que presenten les cèl·lules tumorals.

• English

  Background.

  Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children. Tumor cells commonly express tyrosine hydroxylase (TH), the first enzyme of the cathecolamine byosinthesis. TH expression has been frequently found in peripheral blood and bone marrow of patients with advanced-stage neuroblastoma. Since TH expression not always correlates with clinical behaviour, we decided to quantify the amount of residual disease in a group of neuroblastoma patients.

  Objective.

  To evaluate the usefulness of the RT-NestedPCR technique in the study of minimal residual disease in neuroblastoma.

  Methods.

  We used a nested-RT-PCR assay for TH with serial dilutions, in five patients with advanced neuroblastoma. Patients were monitored at diagnosis, during treatment, and at regular intervals after completion of therapy. Twenty samples of peripheral blood and 13 bone marrow samples were analyzed. We used peripheral blood from 30 healthy donors as negative control, and the IMR-32 cell line as positive control. The sensitivity of the assay was stablished in the detection of 1 tumor cell in 107 normal cells.

  Results.

  TH gene expression was found in 65% of peripheral blood and in 46% of bone marrow from neuroblastoma patients. We also found TH expression in 33% of the samples of peripheral blood from healthy donors. The specificity of PCR products was determined by sequentation.

  In four out of five patient studied, we found a relative increase in the degree of residual disease over the period analyzed. Two of them presented a clinical relapse, and two remain disease-free. The other patient who presented stable levels of residual disease is disease-free.

  Conclusions.

  The quantification of residual disease in neuroblastoma by the analysis of TH expression allows to differentiate patients with minimal residual disease whose levels of expression change over the time. The detection of TH expression in the peripheral blood of healthy donors suggest the presence of illegitimate expression.