Resumen de Selección de genes de referencia en semen equino criopreservado para su uso en estudios de expresión genética con la técnica de PCR cuantitativa

Almudena Pérez Rico, Francisco Crespo Castejón, Mª Lourdes Sanmartín Sánchez, María Miró Arias, José Luis Vega Plá

• español

  Introducción: La gestión de bancos de germoplasma implica la conservación y uso de dosis seminales, pero también pueden ser una fuente de estudio sobre la calidad de los sementales y las propiedades del semen para su empleo post descongelación. Un criterio para medir la calidad seminal puede basarse en las diferencias de expresión de algunos genes implicados en la espermatogénesis y la maduración espermática. Objetivo: Análisis de genes expresados en semen equino criopreservado que ofrezcan una adecuada amplificación, especificidad y estabilidad para su empleo como genes de referencia en futuros estudios de expresión genética. Material y métodos: Purificación de espermatozoides vivos mediante un gradiente de concentración discontinua a partir de pajuelas de semen criopreservado correspondiente a cuatro sementales. Extracción orgánica de ácidos ribonucleicos con tratamiento con la enzima desoxiribonucleasa y la amplificación selectiva de siete genes candidatos mediante retrotranscripción y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real en un solo paso. Resultados: Tres de los genes seleccionados, β-Actina , Ubiquitina B y proteína Ribosomal L32 se amplifican correctamente. β-Actina , Ubiquitina B manifiestan la mayor estabilidad. Conclusión: En los espermatozoides procedentes de muestras de semen criopreservado equino se puede detectar la presencia de ARNm, siendo el gen de la β-Actina y de la Ubiquitina B los más indicados como genes de referencia de los siete candidatos analizados.

• English

  Introduction: The germoplasm bank management involves the conservation and use of semen doses, but can also be a source of study on the quality of stallions and semen properties for use after thawing. A criterion for measuring the semen quality may be based on differences in expression of some genes involved in spermatogenesis and sperm maturation. Objective: Analysis of genes expressed in equine cryopreserved sperm that can provide adequate amplification, specificity and stability for use as future reference genes in gene expression studies. Material and methods: Purification of live sperm through a discontinuous concentration gradient from cryopreserved semen straws corresponding to four stallions. Organic extraction of ribonucleic acids with deoxyribonuclease treatment and the selective amplification of seven candidate genes using a retrotranscription and a real time chain reaction of the polymerase in one step mode. Specificity is tested by melting curves and agarose gel electrophoresis. Also the stability of the genes is calculated. Results: Three of the selected genes, α-actin, Ubiquitin B and Ribosomal protein L32 were properly amplified. β-Actin and Ubiquitin B showed the best stability. Conclusion: mRNA was amplified from equine cryopreserved semen samples, being the β-Actin and the Ubiquitin B genes the most suitable reference genes of the seven candidates analyzed.