Resumen de Uracil-DNA-glycosilase system (UDG-dUTPs) incorporation in nested PCR reaction for Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax detection: a strategy for reducing risk of contamination

Carlos Herrera, Tatiana María Lopera Mesa

• español

  La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se emplea en investigación y como prueba diagnóstica para confirmar la infección malárica en muestras clínicas. Por ser un método con una sensibilidad cercana a 100%, es susceptible a la contaminación por amplicones, cuando se procesa un gran volumen de muestras, aumentando el riesgo de falsos positivos. Este estudio evaluó la incorporación del sistema uracilo ADN glicosilasa (UDG)-dUTPs en la reacción de PCR anidada (nPCR) para Plasmodium falciparum y Plasmodium vivax, como estrategia para prevenir la contaminación por amplicones en nuevas reacciones. Se empleó ADN de la cepa 3D7 de P. falciparum y una muestra clínica con infección confirmada por P. vivax. Se evaluó el efecto de reemplazar dTTPs por dUTPs en la reacción de nPCR y se verificó su efecto en el límite de detección. Se evaluó la acción degradante de la enzima UDG en reacciones de PCR contaminadas artificialmente con amplicones. Se cuantificó el ADN contaminante que fue capaz de degradar una unidad de UDG en este sistema. La sustitución de dTTPs por dUTPs no afectó la función de la Taq polimerasa, sin embargo, se observó una ligera disminución en la sensibilidad analítica de la nPCR cuando se incorporaron dUTPs. En reacciones contaminadas, la UDG fue capaz de degradar exclusivamente los amplicones contaminantes, sin afectar la amplificación del ADN nativo. Una unidad de UDG logró degradar completamente hasta 6 pg/µl de ADN contaminante. El sistema UDG-dUTPs puede prevenir la contaminación para mejorar el diagnóstico molecular en malaria.

• English

  Polymerase chain reaction (PCR) has been used in research and diagnostics as method to confirm malaria infections. Due to its high sensitivity, this method is susceptible to amplicon contamination, when high number of samples are processed, increasing the risk of false positives. This study aimed at evaluating the incorporation of Uracil DNA glycosylase-dUTPs (UDG-dUTPs) system to nested PCR reaction (nPCR) for Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax, as a strategy to prevent contamination in new reactions. The DNA of P. falciparum 3D7 strain and a clinical sample confirmed with P. vivax were used in all reactions. The effect of replacing dTTPs by dUTPs in nPCR reaction was evaluated, and the effect of this modification on the limit of detection was verified. The degradative action of the UDG was evaluated in artificially contaminated reactions with amplicons. The amount of contaminating DNA that was degraded by a unit of UDG was quantified. Replacement of dTTPs by dUTPs did not affect Taq polymerase performance, however, a slight decrease in the analytical sensitivity of nPCR when using dUTPs was observed. UDG was able to exclusively degrade the contaminants without affecting the amplification of the native DNA. One unit of UDG was able to completely degrade contaminating DNA up to approximately 6 pg/μL. UDG-dUTPs system can prevent contamination to improve molecular malaria diagnosis.