Detección molecular de Dientamoeba fragilis en heces: Eliminación de los inhibidores de la DNA polimerasa

• CLAUDIA IRENE MENGHI ^[1] ; CLAUDIA LILIANA GATTA ^[1] ; R MAKIYA ^[1] ; OSCAR CESAR MÉNDEZ ^[1]
  1. [1] Universidad de Buenos Aires

     Universidad de Buenos Aires

     Argentina

     
• Localización: Parasitología latinoamericana, ISSN-e 0717-7712, ISSN 0717-7704, Vol. 61, Nº. 1-4, 2006, págs. 146-151
• Idioma: español
• Títulos paralelos:
  • Molecular detection of dientamoeba fragilis in faeces: Removal of dna- polymerase inhibitors
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• Resumen
  • español

    Se realizó un estudio de purificación del DNA de los trofozoitos de Dientamoeba fragilis a partir de muestras fecales humanas congeladas, no fijadas en formol, y con elevadas concentraciones de inhibidores de la DNA polimerasa. Para tal fin, se utilizaron columnas ("spin-columns") disponibles en el comercio. Esta metodología se comparó con una técnica tradicional de purificación con fenol/cloroformo. Ambos métodos fueron seguidos de la amplificación del DNA de D. fragilis por una "nested" PCR y posterior electroforesis en un gel de agarosa de los amplicones obtenidos. La extracción del DNA a partir de trofozoitos de D. fragilis - mediante el procedimiento de las columnas - produjo DNA de elevada calidad, libre de impurezas e inhibidores de la polimerasa. Por el contrario, con la técnica de fenol/cloroformo se observó la inhibición de la enzima, cuando se analizaron los productos de amplificación. Además, se confirmó que el agregado de SAF (solución de acetato de sodio - ácido acético - formol) a las muestras fecales afecta la integridad del DNA y como consecuencia impide su posterior amplificación

  • English

    We report an assay for the DNA purification of Dientamoeba fragilis trophozoites by means of a commercially available spin-columns technique from frozen non-formalin-fixed human stool specimens containing high concentrations of DNA -polymerase inhibitors. This method was compared with a phenol/chloroform technique; followed both of them by an amplification assay and an electrophoresis of amplicons. A nested PCR assay was developed to allow the detection of D. fragilis DNA. The DNA extraction from D. fragilis trophozoites using a fast spin-columns procedure, yielded high-quality DNA, free of impurities and enzyme inhibitors; in contrast with the phenol/chloroform technique, where inhibition was observed when the amplification products were analyzed by agarose-gel electrophoresis. Besides, the addition of SAF (sodium acetate-acetic acid-formalin) to faecal specimens, that affects the integrity of DNA and, consequently, hinders its further amplification, was confirmed