Determinación de la eficiencia de secreción de una proteína recombinante en la levadura S. cerevisiae mediante análisis electroforético y detección por Western Blot

• Autores: Sandy Nelly Mansilla García, Ana Akemi Kitazono Sugahara
• Localización: Revista de la Sociedad Química del Perú, ISSN-e 2309-8740, ISSN 1810-634X, Vol. 89, Nº. 3, 2023, págs. 240-248
• Idioma: español
• Títulos paralelos:
  • Determination of the secretion efficiency of a recombinant protein in the yeast S. cerevisiae by electrophoretic analysis and Western- Blot detection
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    RESUMEN En este trabajo se determinaron los niveles de secreción conferidos por dos diferentes mecanismos en la levadura Saccharomyces cerevisiae, aplicados a la enzima glutatión S- transferasa (GST) y mediante ensayos de electroforesis y Western blot (o transferencia Western). Se construyeron previamente plásmidos que permiten la producción de dos tipos de GST fusionadas con sendas secuencias que facilitan su secreción (péptidos de señal, PS): el PS-Alfa (derivado del factor de apareamiento alfa) y un PS-sintético (diseñado a partir de secuencias de consenso derivadas de proteínas que son eficientemente secretadas en la levadura). Después de la separación electroforética de las muestras de proteínas intracelulares y extracelulares, se realizó un ensayo de Western blot que permitió la detección específica de GST mediante un anticuerpo monoclonal. Los ensayos permitieron la identificación de varias formas de GST, en su forma procesada extracelular (26 kDa) y otras de mayor tamaño, siempre intracelulares, dependiendo del péptido señal (PS) utilizado. Sin embargo, no se observaron diferencias en los niveles extracelulares de GST, demostrando que con las condiciones aplicadas, ambos péptidos señal son similarmente eficientes en la promoción de la secreción de proteínas.

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    ABSTRACT The main goal of this work was to investigate the secretion levels that can be achieved when using two different mechanisms in the yeast Saccharomyces cerevisiae and the enzyme glutathione S-transferase (GST), and via electrophoresis and Western-blotassays. The respective plasmids were previously constructed, which allowed the production of the GST enzyme fused to two different secretion signals (signal peptides, SP): the alpha SP (derived from the alpha mating factor) and a synthetic SP (designed from consensus sequences derived from proteins that are known to be efficiently secreted in yeast). After the intracellular and extracellular protein fractions were separated by electrophoresis, a Western blot assay was performed using a monoclonal anti-GST antibody for the specific detection of the protein. These assays allowed the identification of several intracellular forms of GST with diverse sizes depending on the SP, but only the mature 26 kDa form was found in the extracellular fraction. However, no difference was observed on the extracellular levels of GST, which indicated that, under the applied conditions, both SPs are similarly efficient promoting protein secretion.