Luis Ruiz, Dan Erick Vivas Ruiz, Fanny Lazo, Wolfram Seifert, Edith Rodriguez, Gustavo Sandoval, Armando Yarlequé
Se ha purificado una enzima coagulante del veneno de la serpiente Bothrops brazili denominada enzima similar a trombina (TLE) mediante tres pasos cromatográficos sucesivos sobre Sephadex G-75, DEAE Sephadex A-50 y Sephadex G-50, empleando buffer Tris-HCl 0,05 M pH 8,5. La enzima fue purificada 15,9 veces con un rendimiento del 28,6 % y por PAGE-SDS se obtuvo una sola banda proteica de 48 kDa, tanto en condiciones reductoras como no reductoras usando 2β-Mercaptoetanol. Se trata de una proteína con actividad coagulante, tanto sobre plasma humano citratado como sobre fibrinógeno bovino. La enzima mostró actividad amidolítica sobre el sustrato cromogénico Benzoil-Arginil-p-Nitroanilina (BApNA) y la potencia coagulante sobre el fibrinógeno bovino fue calculada en 121 unidades NIH de trombina/mg. La enzima fue inhibida por PMSF y por el inhibidor de tripsina de soya, por lo que se trata de una serinoproteasa; el pH óptimo para la actividad amidolítica fue de 8,5 y la proteína fue estable al tratamiento térmico solo hasta los 40 ºC. La dosis defibrinogenante mínima fue 8 μg/g de ratón y mediante pruebas de inmunodifusión doble se observó inmunorreactividad con respecto al suero antibotrópico polivalente del INS
A coagulant enzyme from Bothrops brazili snake venom called thrombin-like enzyme was purified by three successive chromatographic steps on Sephadex G-75, DEAE Sephadex A-50 and Sephadex G-50 using 0.05M Tris-HCl buffer pH 8.5. The enzyme was purified 15.9 times with a yield of 28.6% and by PAGE-SDS a single protein band of 48 kDa was obtained both in reducing and non-reducing conditions using 2β-Mercaptoethano., It is a unicatenary protein with coagulant activity on both citrated human plasma and bovine fibrinogen. The enzyme showed amidolytic activity on the chromogenic substrate Benzoyl-Arginyl-p- Nitroaniline (BApNA) and the coagulant potency on bovine fibrinogen was calculated on 121 NIH units of thrombin / mg. The enzyme was inhibited by PMSF and the soybean trypsin inhibitor, therefore, it is a serine protease; the optimum pH for the amidolytic activity was 8.5 and the protein was stable to heat treatment only up to 40 °C. The minimal defibrinogenating dose was 8 μg / g of mouse and by double immunodiffusion tests immunoreactivity was observed with respect to INS polyvalent antibothropic serum
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