Resumen de Reconstitución de la inmunidad celular T frente a citomegalovirus y control de la viremia en el paciente receptor de trasplante alogénico de precursores hematopoyéticos
Durante los últimos años la incidencia de la enfermedad orgánica causada por el Citomegalovirus (EOC) en los pacientes receptores de un trasplante alogénico de células precursoras hemotopoyéticas ha disminuido por el uso profiláctico o anticipado del ganciclovir e, indirectamente, el advenimiento de procedimientos muy sensibles para detectar la presencia del CMV en la sangre periférica (viremia): la PCR y la prueba de la antigenemia pp65 (AG). Aun así, la EOC continúa siendo una causa demasiado frecuente de morbididad y mortalidad en estos pacientes. Además, la administración profiláctica generalizada de ganciclovir predispone al paciente a sufrir infecciones bacterianas y fúngicas graves debido a que el ganciclovir produce neutropenia, y se asocia con una mayor incidencia de EOC tardía, probablemente porque el ganciclovir retarda la recuperación de la inmunidad celular específica frente al CMV. No existe consenso en considerar que esta estrategia mejore significativamente la supervivencia de estos enfermos. La estrategia preventiva de la EOC basada en la administración selectiva de ganciclovir a aquellos pacientes en los que se detecta viremia mediante la AG o la PCR de plasma, resulta igualmente eficaz y parece asociarse a una menor incidencia de infecciones fúngicas sistémicas y de EOC tardía; pero un número considerable de los pacientes son tratados innecesariamente. Además, no existe consenso en cuanto al valor umbral de la carga viral de CMV en plasma para iniciar el tratamiento. En este marco, contar con algún otro parámetro analítico que, junto con los marcadores virológicos, permitiera identificar a los pacientes en situación de verdadero riesgo de sufrir una EOC -candidatos ideales a recibir el tratamiento anticipado con ganciclovir-, redundaría en un claro beneficio para éstos puesto que evitaría la exposición superflua al ganciclovir, de cuya toxicidad no cabe duda. El estudio de la cinética de reconstitución de la inmunidad específica frente a CMV en estos pacientes podría proporcionar datos útiles no sólo para guiar el inicio y determinar la duración de los tratamientos anticipados con ganciclovir, sino también para predecir qué pacientes desarrollarán una infección activa por el CMV. El análisis de la inmunidad celular específica frente al CMV, particularmente la cuantificación secuencial de linfocitos T CD8+ citotóxicos (LTC) anti-CMV, parece que proporciona datos potencialmente interesantes para el clínico. En efecto, varios estudios publicados recientemente demuestran que el número de LTCs anti-pp65 (péptidos 495-503 y 417-426), determinado mediante el análisis citofluorométrico de la unión de complejos tetraméricos HLA-péptido a LTCs, se correlaciona inversamente con el riesgo de desarrollar una EOC. Desde nuestro punto de vista, es necesario contrastar esta correlación, puesto que el número de pacientes incluidos en esos estudios no parece suficiente para extraer conclusiones definitivas; por otra parte, el método de los tetrámeros-CMV-marcados, sólo permite analizar a los pacientes HLA-A2 y, en menor medida, los HLA-B7, que no representan más de un 50-60% de la población caucásica. Para circunvenir este problema se ha ideado un método citofluorométrico que permite cuantificar la respuesta T CD8+ frente al CMV con independencia del haplotipo HLA del paciente. No hay datos consistentes sobre la cinética de reconstitución precoz de la función inmunitaria mediada por células T CD4+, cuya relevancia en el mantenimiento de las respuestas T CD8+ frente a CMV parece suficientemente contrastada; por ello, se desconoce si hay o no una correlación entre los niveles periféricos de células T CD4+ anti-CMV y la probabilidad de desarrollar una infección virémica o una EOC. Existen técnicas citofluorométricas que cuantifican los precursores de T CD4+ que reconocen epítopos del CMV. Por otra parte, nuestro grupo dispone de datos preliminares que sugieren que la cuantificación de las células T CD8+ y T CD4+ totales y de la fracción de células T CD8+ y T CD4+ activadas (T CD8+/DR+ y T CD4+/DR+), proporciona información útil para guiar el tratamiento anticipado con ganciclovir. El virus Herpes humano tipo 6 (VHH-6) ha sido recientemente categorizado como un patógeno oportunista clínicamente relevante en los pacientes que reciben un trasplante alogénico de precursores hematopoyéticos, además de su capacidad de mermar o demorar la reconstitución de la inmunidad específica frente al CMV en estos pacientes; este extremo necesita ser comprobado. No existen estudios publicados que hayan abordado este problema. Por ello planteamos los siguientes objetivos: 1. Estudiar la cinética de la recuperación de la respuesta inmunitaria celular T CD4+ y T CD8+ frente al CMV en pacientes receptores de un trasplante alogénico de células precursoras hematopoyéticas en los primeros 180 días tras el trasplante; 2. Comparar el patrón de reconstitución en los pacientes en que se objetiva una infección activa virémica por el CMV (se siga o no de una EOC), con el de aquellos en que no se detecta; 3. Estudiar el efecto de la infección virémica por el Herpesvirus humano tipo 6 (VHH-6) en la reconstitución de la inmunidad frente al CMV en estos pacientes; 4. Determinar si con base en los datos obtenidos podría seleccionarse con mayor rigor a los pacientes que deben ser tratados anticipadamente con ganciclovir. La metodología empleada se detalla a continuación. 1. Pacientes y su seguimiento Se incluirán pacientes receptores de trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos CMV seropositivos con anterioridad al trasplante (R+) que reciban un trasplante bien de un donante CMV seropositivo (D+/R+) o bien de uno CMV seronegativo (D-/R+). Se incluirá a pacientes atendidos en el Hospital Clínico Universitario de Valencia, Hospital Morales Meseguer de Murcia y Hospital de la Princesa de Madrid. Se establecerán cuatro grupos de estudio: el grupo 1 (control) incluirá a pacientes que no desarrollen viremia (PCR-/AG-) durante el periodo de seguimiento; el grupo 2 incluirá a pacientes que desarrollen viremia y no sean tratados anticipadamente con ganciclovir (PCR+/AG-); este grupo nos permitirá analizar la respuesta T CD4+ y T CD8+ en respuesta a la replicación activa del CMV en ausencia de ganciclovir; el grupo 3 incluirá a pacientes virémicos tratados anticipadamente con ganciclovir (PCR+/AG+); el grupo 4 incluirá a pacientes virémicos (demostrada la viremia mediante PCR o AG) que desarrollen EOC. Será necesario que cada grupo incluya un mínimo de 20 pacientes. Se realizarán extracciones de sangre periférica para llevar a cabo los estudios inmunológicos propuestos los días 14 postrasplante (+14), +21, +30, +45, +60, +90, +180. Las determinaciones virológicas (AG y PCR), se realizarán con una periodicidad semanal durante los primeros cuatro meses postrasplante, comenzando una semana antes del trasplante. Se entenderá que un paciente ha desarrollado una infección activa virémica cuando al menos una de las dos pruebas resulte positiva. Los pacientes en los que se detecte antigenemia, recibirán tratamiento anticipado con ganciclovir i.v. durante 15 días o hasta la negativización de la AG seguido de un mes de ganciclovir en régimen de mantenimiento; cuando se objetive la presencia de antigenemia y/o DNAemia (una PCR positiva de DNA de CMV en el plasma) se realizarán extracciones de sangre cada 4 días (hasta que se negativicen las pruebas virológicas) y se realizarán los análisis inmunológicos previstos en este estudio con objeto de monitorizar estrechamente la respuesta T CD4+ y T CD8+ anti-CMV inducida por la replicación del virus; con este propósito, los pacientes PCR+/AG-, los cuales, en su mayoría no serán tratados anticipadamente con ganciclovir, ofrecerán la posibilidad de estudiar la respuesta inmunitaria celular frente al CMV obviando los efectos del ganciclovir. Se llegará al diagnóstico de una EOC cuando se demuestre la presencia del efecto citopático inducido por el CMV en una muestra tisular del órgano afectado obtenida mediante biopsia o necropsia, o se cultive el virus a partir de ella. En el caso de la neumonitis, la detección del CMV en el lavado broncoalveolar mediante PCR o cultivo se considerará diagnóstica en presencia de un cuadro clínico y un infiltrado pulmonar en la radiografía de tórax compatibles. 2. Métodos virológicos La prueba de la antigenemia pp65 se llevará a cabo en las 4 horas siguientes a la extracción de la sangre siguiendo un protocolo publicado por nuestro grupo. Si es positiva, se indicará el número de células en que se que contienen pp65s/2X105 leucocitos polinucleares (LPN). La detección de DNA del CMV en el plasma se realizará mediante una prueba cuantitativa comercial de PCR “real time”. El plasma del paciente permanecerá congelado a -70ºC hasta que se realice la PCR. Para el diagnóstico de la EOC, las muestras clínicas serán inoculadas en “shell vials” tapizados con células HFF y cuando resulte oportuno se detectará DNA viral mediante PCR. La detección del CMV en los cultivos se realizará mediante inmunofluorescencia directa utilizando un anticuerpo monoclonal anti-IE-1 marcado con fluoresceína. La cuantificación de la carga viral plasmática del VHH-6 se efectuará mediante PCR “real-time”. 3. Métodos inmunológicos 3.1. Respuesta inmunitaria T CD8+ frente al CMV Se estudiará mediante la cuantificación de células T CD8+ que producen interferón-? cuando se estimulan con combinaciones de pentadecapétidos solapados de la proteína pp65 e IE-1 del CMV. Esta técnica se realizará a todos los pacientes con independencia de su especificidad haplotípica HLA utilizando reactivos comercializados. En esta técnica se emplean indistintamente CMSP recién obtenidas o conservadas en nitrógeno líquido. Las células IFN-?+/CD8+/CD69+ (marcador de activación de linfocitos T) se cuantificarán en un citómetro FACScalibur (Becton Dickinson). 3.2. Respuesta inmunitaria T CD4+ frente al CMV Se realizará la cuantificación citofluorométrica de linfocitos T CD4+ que producen interferón-? tras estímulo con combinaciones de pentadecapétidos solapados de la proteína pp65 e IE-1 del CMV. En este método se emplean indistintamente CMSP recién obtenidas o CMSP conservadas en nitrógeno líquido. Las células IFN-?+/CD4+/CD69+ se cuantifican en un citómetro FACSscalibur. 3.3. Cuantificación de células T CD8+, T CD8-DR+ y T CD4+ y T CD8-DR+ Se llevará a cabo mediante citometría de flujo utilizando los anticuerpos monoclonales marcados pertinentes. 4. Conservación y transporte de las muestras desde los hospitales colaboradores Las muestras de sangre obtenidas en los hospitales colaboradores serás criopreservadas en el laboratorio de Hematología del hospital de origen y remitidas al Hospital Clínico Universitario mediante transporte urgente. 5. Métodos estadísticos Se emplearán el test de Student o el test U de Mann-Whitney para comparar recuentos celulares en los distintos puntos de análisis. Se obtendrán curvas de Kaplan-Meier de supervivencia libre de infección virémica y de enfermedad hasta el día +180 con base en los recuentos celulares de las distintas subpoblaciones sujetas a estudio.
