Resumen de Omics approaches to study the oral microbiome
Introducción La visión clásica de los microorganismos como agentes infecciosos ha propiciado que se consideren como meros agentes causales de enfermedades. Sin embargo, la larga historia de coexistencia entre microorganismos y los seres humanos, ha hecho que ambos se hayan adaptado mutuamente y coevolucionen (Dubos et al. 1965, McFall-Ngai 2002)?. De hecho, en el cuerpo humano habitan 1014 células bacterianas, un orden de magnitud más que células humanas (Savage 1977)?. Entre los beneficios que la microbiota aporta, están su contribución a digerir alimentos y a aportar nutrientes, regulación del metabolismo, maduración del sistema inmune, etc. Por ello, hoy en día las enfermedades de origen bacteriano no solo se consideran aquellas en las que un único agente causal produce una infección o produce toxinas, sino también aquellas enfermedades causadas por la pérdida de sus efectos beneficiosos. Entre las enfermedades que transcurren con una alteración de la microbiota están la obesidad (Turnbaugh & Gordon 2009, Turnbaugh et al. 2009, Ferrer et al. 2013)?, enfermedad inflamatoria intestinal (Seksik 2010)?, vaginosis bacteriana (Ravel et al. 2013)?, caries dental (Marsh 2010)?, periodontitis (Kumar et al. 2006)?, etc, y por tanto su abordaje terapéutico no puede realizarse de una manera clásica, como por ejemplo mediante el uso de antibióticos o vacunas dirigidas al agente causal. Por ello, el estudio de la microbiota en su conjunto y no limitado a ciertas especies patógenas, es fundamental para entender este nuevo tipo de enfermedades. Las técnicas tradicionales basadas en cultivo, tienen la gran limitación de no ser capaces de aislar a la gran mayoría de microorganismos, tal y como ya observó en 1932 Razumov, quien definió la “gran anomalía del recuento en placa” el hecho de que al cultivar en una placa petri una muestra, tan solo crecían un pequeño número de las bacterias observadas al microscopio (Razumov 1932)?. El desarrollo a finales de los años 90 de técnicas moleculares, permitieron salvar parcialmente las limitaciones del cultivo. Así se observó que prácticamente todas las superficies y cavidades del cuerpo humano están colonizadas por bacterias. Se han encontrado bacterias incluso partes del cuerpo que se creían estériles, tales como el hígado, leche materna, placas de ateroma, placenta, tejido adiposo o en la sangre bajo ciertas condiciones (Burcelin et al. 2013)?. Debido a esta ubicuidad de las bacterias incluso en ausencia de enfermedad, es necesario poder distinguir entre un microbioma sano y uno enfermo, para así poder diagnosticar aquellas enfermedades que transcurren junto con una disbiosis de la comunidad bacteriana, incluso antes de que los síntomas clínicos aparezcan. Grandes consorcios internacionales están llevando a cabo estudios de la microbiota de un gran número de individuos sanos, como por ejemplo el Proyecto del Microbioma Humano estadounidense (HMP 2012)? o el Proyecto META-HIT europeo (Qin et al. 2010)?. Cavidad oral Uno de los nichos del microbioma humano más complejo es la cavidad oral, la cual alberga una gran variedad de subnichos y en consecuencia una enorme diversidad microbiana. Está delimitada por los labios, las mejillas, el paladar (dividido en paladar duro y blando), la lengua y el suelo de la boca. Los dientes son estructuras mineralizadas, que están anatómicamente divididas en dos partes, la corona, la parte visible del diente, y la raíz, que es la parte que se inserta en los alveolos dentales. El diente está compuesto por 3 capas diferenciadas, esmalte (cemento en las raíces), dentina y pulpa. El esmalte es la capa más externa de la corona y es el material más duro del cuerpo humano. Está compuesto en un 96% de material inorgánico, principalmente hidroxiapatita. El cemento es la capa más externa de la raíz y su contenido inorgánico es menor (45%), ya que en él se insertan los ligamentos periodontales, haciendo que un 33% sea material orgánico y un 22% de agua. La dentina tiene un 70% de hidroxiapatita y contiene túbulos dentinarios que albergan una matriz de proteínas colágenas y prolongaciones celulares de los odontoblastos (Goldberg et al. 2011)?. Aunque no está vascularizada, debido a su estructura tubular y contenido celular hace que sea un tejido vivo, capaz de reaccionar frente a estímulos externos. La pulpa es la parte central del diente, y es la única parte del diente que está vascularizada e inervada. Está compuesta principalmente de tejido conectivo y de los cuerpos celulares de los odontoblastos, los cuales se prolongan a través de los túbulos dentinarios. Las glándulas salivares juegan un importante papel en la cavidad oral, que continuamente secretan saliva. La saliva es un fluido acuoso con una pequeña proporción de compuestos disueltos, como moco, glicoproteínas, electrolitos, enzimas y compuestos antibacterianos (Amerongen & Veerman 2002)?. Sus principales funciones son participar en la digestión de grasas y almidón, lubricación de las superficies mucosas y comida para facilitar su deglución, regulación de temperatura y humedad, defensa frente a infecciones, tampón variaciones de pH y control del balance de mineralización-desmineralización del diente. La saliva, al entrar en contacto con las diferentes superficies de la boca, forma una fina capa de unos 8-40 ?m llamada película adquirida. Las glicoproteínas presentes en esta película son utilizadas por las bacterias como anclaje para poder adherirse a la superficie del diente, evitando ser arrastradas por la saliva y ser deglutidas (Jenkinson & Lamont 2005)?. Comunidades microbianas orales Todas las bacterias que viven en la cavidad oral han de ser capaces de adherirse a alguna superficie, para así evitar ser arrastradas junto con la saliva hacia el estómago. Por ello, prácticamente todas las superficies de la boca son susceptibles de ser colonizadas por biofilms bacterianos. La microbiota presente en la saliva, no es considerada como habitante oral, sin embargo su composición es fruto de la descamación de los biofilms de diversas partes de la boca. Además, debida a la gran variedad de condiciones presentes, la composición microbiana varía entre los diferentes micronichos orales (Zaura et al. 2009, Segata et al. 2012, Simón-Soro et al. 2013a)?. Entre las enfermedades orales, caries, gingivitis y periodontitis son las más comunes causadas por microorganismos. Estas enfermedades requieren la formación y acumulación de placa dental, que es un biofilm bacteriano que crece sobre la superficie del diente. Está formado por células bacterianas, fúngicas y epiteliales descamadas, así como glicoproteínas salivares y polisacáridos y proteínas secretadas por microorganismos (Tinanoff & Gross 1976, Mosby 2013)?. La placa supragingival se acumula sobre la superficie visible del diente y favorece el crecimiento de bacterias acidogénicas y acidófilas, y es la causante de la caries dental. La placa subgingival se acumula en el surco subgingival, ente la encía y el diente, es un ambiente neutro o ligeramente alcalino y está principalmente compuesto de bacterias Gram negativas. La placa subgingival se caracteriza por desarrollarse en un ambiente típicamente anaeróbico, con un pH neutro o alcalino, y cuya principal fuente de nutrientes es el líquido crevicular y las células descamadas epiteliales. La acumulación de placa subgingival provoca inflamación en las encías, que puede progresar a periodontitis, inflamándose los tejidos de soporte del diente, perdida de hueso alveolar y potencialmente, la pérdida de la pieza dental (Kawar et al. 2011)?. Las especies bacterianas asociadas tradicionalmente a gingivitis y periodontitis son las que componen el complejo rojo, Tannerella forsythia, Treponema denticola y Porphyromonas gingivalis (Socransky et al. 1998)?. Sin embargo, estudios más recientes también sugieren la implicación de un mayor número de especies en esta patología (Kumar et al. 2006, Fritschi et al. 2008, Colombo et al. 2009, Griffen et al. 2012)?. Esto hace que el origen de la gingivitis/periodontitis sea polimicrobiano. La placa supragingival crece sobre las superficies del diente no cubiertas por encía. Las bacterias que viven en este nicho, han de ser capaces de soportar las fuerzas mecánicas de los movimientos de la lengua, saliva, mejillas y masticación, mediante su adhesión. Prácticamente todos los habitantes de la placa supragingival son capaces de adherirse a la película adquirida o a otro de los miembros de la placa (Kolenbrander et al. 2006)?. Aunque en principio es un ambiente aeróbico, si el biofilm adquiere cierto grosor, el oxígeno puede ser consumido por las bacterias aeróbicas, creando zonas de microaerofilia dentro del biofilm, favoreciéndose el crecimiento de anaerobios. Las principales fuentes de nutrientes son las glicoproteínas salivares, restos de comida y los componentes celulares desprendidos del epitelio. La actividad metábolica de este biofilm es responsable de la acidificación que causa la desmineralización del esmalte, iniciándose las lesiones de caries. Caries dental La caries dental es la patología derivada de la disolución de la superficie orgánica y mineral del diente, causada esta última por los ácidos producidos por los microorganismos de la placa dental supragingival (Fejerskov et al. 2008)?. En condiciones de pH neutro, hay un equilibrio entre mineralización y desmineralización del esmalte, ya que la película adquirida sobre éste está saturada de hidroxiapatita. Cuando el pH baja fruto del metabolismo microbiano de azúcares fermentables, la solubilidad de la hidroxiapatita aumenta y se favorece la desmineralización del esmalte. Una vez los azúcares dejan de estar disponibles, la capacidad de tampón de la saliva hace aumentar de nuevo el pH, reestableciéndose de nuevo el equilibrio. Además, la película adquirida, sobresaturada de iones fosfato y calcio, favorece su precipitación y la remineralización del esmalte. La caries dental se inicia cuando estos ciclos de desmineralización-remineralización se descompensan y aumenta la desmineralización, dándose una pérdida neta de mineral. Gracias a todo el conocimiento acumulado, diferentes teorías se han ido planteando sobre la contribución microbiana a la caries dental. Una de las primeras fue la hipótesis de la placa no específica planteada por Miller (Miller 1890)?. En ella sugería que los ácidos producidos por el conjunto de las bacterias presentes en la placa dental al proporcionarles azúcar o almidón eran los responsables de la degradación del esmalte, y no eran fruto de una única especie. También propuso que la caries era una enfermedad con dos etapas, la primera caracterizada por la disolución ácida del esmalte, y la segunda caracterizada por la descomposición de las “sustancias albuminosas” de la dentina, una vez esta queda expuesta. Más tarde, se propuso la hipótesis específica de la placa (Loesche 1986)?, coincidiendo con el descubrimiento de Streptococcus mutans. Fitzgerald y Keyes demostraron que esta especie acidogénica era capaz de producir lesiones de caries por sí sola en hamsters albinos (Fitzgerald & Keyes 1960)?. Otras especies propuestas como patógenas siguiendo esta hipótesis específica son Streptococcus sobrinus, Lactobacillus casei y Actinomyces odontolyticus (Loesche 1986)?. La hipótesis de la placa ecológica propuesta por Marsh (Marsh 1994b)?, plantea que la caries tiene lugar cuando una fuente de estrés para el ecosistema de la placa dental, como por ejemplo un mayor aporte de azúcares en la dieta, produce un cambio ambiental en el nicho, una bajada de pH, fruto de la fermentación de éstos. Esta bajada de pH, además de aumentar el riesgo de caries, favorece un cambio en la comunidad bacteriana en la placa dental, debido a la selección de especies acidófilas y acidogénicas. Esto termina por retroalimentar una mayor producción de ácido y por tanto aumentar el riesgo de caries. Por tanto, se considera que la caries acontece junto con una disbiosis de la microbiota, causante última de la caries. Problemas para estudiar la caries dental Aunque la caries dental ha estado presente en el ser humano durante miles de años, no se ha podido encontrar niguna cura efectiva. Entre los múltiples motivos que dificultan el estudio de esta patología se encuentran la falta de consenso sobre la etiología de la enfermedad, a la vista de las múltiples teorías que se han ido planteando a lo largo del tiempo (Rosier et al. 2014)?. El hecho de ser una enfermedad polimicrobiana, no cumplir los postulados de Koch clásicos (Koch 1870)?, tener un largo período de desarrollo hasta que las lesiones son detectables, ha dificultado su abordaje. Esto unido al gran número factores que influyen en la aparición de la enfermedad, ha hecho que los esfuerzos realizados no hayan sido capaces de encontrar un tratamiento para evitar la caries dental. Por otro lado, las técnicas clásicas de microbiología basadas en el cultivo de cepas ha dificultado el conocimiento exhaustivo del microbioma oral. Aún siendo éste uno de los ecosistemas con más miembros cultivables, tan solo ha sido posible cultivar alrededor del 50% de todos sus habitantes (Paster et al. 2001, Wade 2002, Donachie et al. 2007, Marsh et al. 2011)?. Esto ha proporcionado una visión sesgada de este ecosistema, estudiándose únicamente aquellas especies cultivables. La introducción de técnicas moleculares como la clonación, DGGE, microarrays de DNA y RNA y secuenciación del gen 16S rRNA, han mejorado el conocimiento acerca de la diversidad taxonómica en la placa dental, pero presentan un gran número de sesgos y limitaciones (Nyvad et al. 2013)?. Las técnicas clásicas moleculares no permiten conocer por ejemplo el conjunto de funciones que una comunidad bacteriana puede llevar a cabo, los genes que se están transcribiendo en determinadas circunstancias o el contenido proteico en su conjunto. Nuevas técnicas para estudiar la caries dental Como consecuencia de estos factores que influyen en la aparición de caries, se necesitan nuevas herramientas que permitan superar las limitaciones existentes. En la última década se han introducido técnicas de alto rendimiento que permiten superar las limitaciones del cultivo, mediante el estudio de moléculas informativas de las comunidades microbianas, como el DNA, RNA, proteínas y metabolitos (Zoetendal et al. 2008, Nyvad et al. 2013)?. El análisis de los ácidos nucleicos ha vivido una revolución con la introducción de las técnicas de secuenciación de segunda generación, que han permitido aumentar la cantidad de bases secuenciadas por carrera. A la vez se ha disminuido el tiempo necesario y el coste de obtener la misma cantidad de secuencias. Esto ha permitido el uso de la secuenciación directa tanto de DNA y RNA, obviando la necesidad de cultivo y otras limitaciones asociadas a las técnicas moleculares clásicas como el DGGE, amplificación y secuenciación del gen 16S rRNA, etc. La metagenómica se desarrolló para poder estudiar los genomas presentes en el conjunto de una comunidad bacteriana, y así poder obtener mayor información que con las técnicas basadas en un solo gen marcador filogenético (16S rRNA). De esta manera se puede obtener información sobre la composición taxonómica de la comunidad analizada, así como del total de funciones que potencialmente pueden ser llevadas a cabo. La metatranscriptómica, mediante el análisis de las moléculas de RNA, da a conocer qué especies y genes están transcripcionalmente activos en un momento determinado, lo cual permite conocer las adaptaciones del conjunto de la comunidad bacteriana ante diferentes condiciones ambientales. Por último, la metaproteómica permite conocer las proteínas presentes en la comunidad, reflejando de forma más cercana la actividad funcional que se lleva a cabo. Objetivos El estudio de las comunidades microbianas asociadas al cuerpo humano han experimentado un gran auge desde el inicio del siglo XXI, debido a la introducción de nuevas técnicas de alto rendimiento y eficiencia. Por lo tanto ha permitido estudiar la relación existente entre muchas enfermedades y las comunidades microbianas que poseen los pacientes. A lo largo de esta tesis, algunas de estas nuevas técnicas se han aplicado al estudio de la microbiota de la placa dental humana, para responder a múltiples cuestiones biológicas relativas a la caries dental. Técnicas de secuenciación de alto rendimiento y de metagenómica se han utilizado para salvar las limitaciones inherentes a las técnicas tradicionales basadas en el cultivo de cepas, en un único gen como el 16S rRNA o técnicas de clonación, con el objetivo de descifrar la composición microbiana en estados de salud y enfermedad. El hilo conductor de esta tesis ha sido profundizar en el conocimiento disponible sobre el microbioma en su conjunto y en la porción transcripcionalmente activa, bajo diferentes estados de salud y enfermedad, con el objetivo profundizar en la etiología de la caries dental y proponer estrategias de prevención y diagnóstico. Este objetivo global se subdivide en los siguientes objetivos específicos: Caracterización taxonómica de la comunidad microbiana presente en la placa dental de individuos sanos y con caries, mediante el uso de técnicas no limitadas de antemano ni sesgadas por metodologías como el cultivo, la amplificación mediante PCR o la clonación. Caracterización del potencial genético de los microorganismos habitantes de la placa dental supragingival. Esto debe determinar si las diferencias taxonómicas entre individuos sanos y con caries también se corresponden con diferencias funcionales. Detección de bacterias potencialmente protectoras frente a la caries procedentes de individuos sanos, que puedan ser susceptibles de desarrollo como probióticos anticaries. Proponer posibles genes de virulencia en los genomas de bacterias patógenas, mediante su comparación con muestras metagenómicas de voluntarios sanos, obtenidas del mismo ecosistema de donde se aisló al patógeno en cuestión. Comparar la comunidad microbiana encontrada mediante metagenómica en los biofilms dentales con la fracción transcripcionalmente activa, para poder diferenciar entre las bacterias de paso de las activas en este nicho. Caracterizar las especies transcripcionalmente activas durante la bajada de pH que tiene lugar sobre la superficie del diente después de la ingesta de comidas ricas en carbohidratos, para descubrir las bacterias activas durante la metabolización de azúcares y producción de ácido, potencialmente responsables de la caries dental. Comparar la composición del microbioma oral mediante técnicas metagenómicas, metatranscriptómicas y metaproteómicas. Describir por primera vez el catálogo de proteínas humanas y bacterianas presentes en la placa dental supragingival. Buscar posibles biomarcadores de salud y enfermedad en caries dental que puedan ser potencialmente utilizados en un test diagnóstico. Resultados y conclusiones En el capítulo 3.1 de la presente tesis, investigamos las diferencias a nivel taxonómico y funcional de muestras de placa dental de voluntarios sanos, con caries y muestras obtenidas de lesiones avanzadas de caries, mediante la secuenciación directa del DNA extraído (Alcaraz et al. 2012, Belda-Ferre et al. 2012)?. El uso de la metagenómica nos permitió observar que la composición taxonómica, aún siendo similar a otros estudios previos basados en técnicas diferentes, presentaban ciertas diferencias, como un mayor número de géneros minoritarios no detectados por técnicas de PCR del gen 16S rRNA. Al comparar las muestras de individuos sanos con muestras de pacientes con caries, observamos diferencias en la composición taxonómica, corroborando que la caries dental está asociada a un cambio en la microbiota a nivel taxonómico, de acuerdo con la hipótesis ecológica de la placa. Además, al disponer de secuencias procedentes del conjunto de genomas presentes en las muestras, pudimos observar que las diferencias no se debían únicamente a la presencia de diferentes géneros o especies, sino también a diferentes cepas de la misma especie. Tras observar que las personas sanas eran portadoras de cepas de Streptococcus diferentes a las presentes en personas con caries, aislamos 192 cepas. De éstas, se seleccionaron varios aislados debido a su potencial como probiótico protector frente a caries dental, dos de las cuales se describieron como la nueva especie Streptococcus dentisani (Camelo-Castillo et al. 2014)?, y en la actualidad están siendo desarrolladas para su comercialización. Este capítulo muestra por tanto cómo la metagenómica puede ayudar a identificar microorganismos con potencial probiótico. En cuanto a la composición funcional, se pudo comprobar que la microbiota intestinal y de la placa dental, no solo se diferencian a nivel taxonómico, sino que también el repertorio funcional de la microbiota de estos dos ecosistemas es diferente. Al poder asignar a cada lectura de DNA tanto una afiliación taxonómica como funcional, se pudo relacionar qué funciones eran llevadas a cabo por cada grupo taxonómico. Se encontraron diferencias entre sujetos sanos y con caries, que incluían funciones sobrerrepresentadas en sujetos sanos, en concreto funciones relacionadas con péptidos antibacterianos, genes de respuesta a estrés periplásmico y polisacáridos extracelulares. En los individuos con caries activas, se encontró que estaban sobrerrepresentadas las funciones relacionadas con fermentación ácida, incorporación de DNA y competencia. Por último, este trabajo fue el primero en secuenciar de forma directa DNA bacteriano procedente de lesiones de caries. Esto permitió observar que son ecosistemas complejos en el que habita una gran diversidad de especies, y en el que S. mutans se muestra prácticamente ausente. En estudios posteriores se pudo confirmar que S. mutans estaba presente en lesiones de mancha blanca, aunque su proporción siempre era menor al 1% (Simón-Soro et al. 2014)?. Estos resultados sugieren que la caries está causada por un conjunto de bacterias diferentes a las encontradas en personas sanas, aunque no existe una única combinación de bacterias cariogénicas. En el capítulo 3.2 se propuso un método basado en la metagenómica para poder detectar posibles genes de virulencia presentes en cepas patógenas (Belda-Ferre et al. 2011)?. Éste consiste en comparar el genoma de la cepa patógena en cuestión frente a un metagenoma de una persona sana, obtenido del mismo lugar donde se aisló la cepa. Así las regiones del genoma que no están presentes en el metagenoma, llamadas islas metagenómicas, suelen contener genes hipervariables como los que codifican proteínas expuestas de la pared celular, sometidas a presión selectiva debido al ataque de fagos o del sistema inmune. En el caso de bacterias patógenas, cuando el potencial patógeno es debido a un gen o grupo de genes (p.ej. toxinas), estos suelen estar ausentes en las cepas no patógenas, haciendo que la comparación entre cepas patógenas y no patógenas sea una estrategia para la búsqueda de estos genes de virulencia. Sin embargo, el gran número de genes no compartidos por cepas de la misma especie, el “pangenoma accesorio” (D’Auria et al. 2010)?, hace necesaria la comparación de múltiples cepas para poder encontrar genes de patogenicidad potenciales (Ho Sui et al. 2009, D’Auria et al. 2010, Hilker et al. 2014)?. Esta estrategia está limitada por la necesidad de aislar suficientes cepas, lo que podría estar sesgado hacia aquellas cepas mejor adaptadas al crecimiento en condiciones de laboratorio. Como alternativa, la metagenómica permite comparar el conjunto de cepas presentes en un nicho obviando el paso de cultivo frente a la cepa patogénica en cuestión mediante los gráficos de reclutamiento. Esto facilita la detección de candidatos a genes de virulencia cuando se detecta un brote infeccioso y se requieren aplicar medidas epidemiológicas preventivas, como el caso del brote por E. coli O104:H4 enterohemorrágica (Qin et al. 2011, Ahmed et al. 2012)?. Este capítulo prueba que el método es fiable al identificar claramente genes de virulencia conocidos, y propone nuevos candidatos en bacterias orales e intestinales. En el capítulo 3.3 se abordaron dos de los procesos de los que depende la aparición de caries, la formación de biofilm y la producción de ácido por la fermentación de carbohidratos, mediante una aproximación de metatranscriptómica (Benítez-Páez et al. 2014)?. La formación del biofilm de la placa dental se ha estudiado tradicionalmente mediante el uso de modelos in vitro (Kolenbrander et al. 2006)? o con técnicas de microarrays de DNA (Li et al. 2004, Teles et al. 2012)?. Sin embargo, no se conoce mucho en condiciones in vivo, ni de la actividad funcional a lo largo de este proceso. Este trabajo se planteó para intentar conocer qué bacterias de las que se adhieren al diente son activas así como el patrón de expresión de éstas en la placa dental supragingival durante diferentes etapas de su formación tras una limpieza dental profesional (6, 12, 24 y 48 horas). Así se pudo observar una gran diversidad de especies activas en todas las etapas analizadas, incluyendo correlaciones en la actividad de varios habitantes orales, tanto positivas (mutualistas) como negativas (potencialmente antagonistas). Esto sugiere que la adhesión al biofilm puede no ocurrir mediante una sucesión ecológica, o que ésta tiene lugar en períodos de tiempo más cortos que los propuestos hasta la fecha. Una posible explicación es que las células bacterianas que forman agregados presentes en la saliva o adheridos a células epiteliales, se adhieren a la vez a la superficie del diente (Cabello Yeves 2014)?. En función de las condiciones ambientales del biofilm, aquellos que estén mejor adaptados a ellas mostrarán mayor actividad transcripcional. En cuanto a los tránscritos de mRNA, encontramos diferentes patrones de expresión entre las muestras de biofilm tempranas (6 y 12 horas) y las tardías (24 y 48 horas). Entre las 35 categorías sobre-expresadas en las muestras tempranas se encuentran genes relacionados con funciones housekeeping y de aprovechamiento de recursos, que sugieren una reducida competencia en los momentos iniciales de formación del biofilm. Sin embargo, en las muestras tardías se encuentran sobre-expresadas funciones de motilidad celular, transportadores ABC, sistemas de reparación de DNA y de recombinación homóloga, reflejando la importancia de la comunicación entre células y la detección de señales del ambiente, lo que puede indicar una mayor competencia por los nutrientes limitados en el biofilm maduro. La otra cuestión abordada en el capítulo 3.3 fue determinar qué habitantes de la placa dental supragingival eran transcripcionalmente más activos durante la bajada de pH que sucede tras la ingesta de una comida rica en carbohidratos, para así poder identificar los posibles miembros productores de ácido o ácido tolerantes, y por tanto, posibles contribuyentes a la etiología de la caries. Uno de los resultados observados fue una gran dominancia a nivel transcripcional de los géneros Actinomyces, Corynebacterium y Rothia, a los que correspondía más del 80% de los tránscritos. Usando otras aproximaciones no basadas en RNA su contribución porcentual al total de la comunidad microbiana es mucho menor (capítulo 3.1), lo cual demuestra la necesidad de aplicar diferentes técnicas para poder tener una mejor visión global de cómo funciona un ecosistema. En cuanto a los cambios observados entre las muestras de antes y después de la ingesta de la comida rica en carbohidratos, no se observó un patrón específico. Sin embargo se detectó en algunos individuos una mayor resiliencia en la comunidad activa frente a los cambios de pH, mientras que en otros los cambios fueron muy pronunciados. Además se observó una mayor actividad transcripcional de Actinomyces en las personas sanas, que podría ser un factor protector frente a la acidificación del biofilm, aunque no se pudo determinar a qué especie en concreto se correspondía. En el último capítulo de esta tesis (Capítulo 3.4), se realizó el primer estudio metaproteómico aplicado a la placa dental supragingival humana. Los objetivos principales eran describir el conjunto de proteínas traducidas en la placa dental, así como indagar en las diferencias entre personas sanas y con caries, para proponer dichas diferencias como posibles marcadores de salud y enfermedad. En la primera aproximación, se utilizó un prefraccionamiento HILIC de las proteínas digeridas con tripsina obtenidas de un total de 17 muestras combinadas, seguido de nanoLC-MS/MS. Con esta aproximación conseguimos detectar un total de 7771 proteínas bacterianas y 853 humanas, observándose una gran dominancia con diferencias de hasta 3 órdenes de magnitud entre las proteínas identificadas a mayor y menor concentración. En cuanto a las diferencias entre muestras en estado de salud y enfermedad, procedimos a cuantificar de manera individual las proteínas presentes en las muestras de placa dental supragingival de 17 voluntarios (9 con caries y 8 sin caries). En esta aproximación se pudieron detectar más de 1000 proteínas por muestra de media. Entre las proteínas con mayor abundancia en personas sanas que en pacientes con caries, se encuentran enzimas relacionadas con mecanismos que afectan al pH del biofilm (L-lactato deshidrogenasa y ornitina carbamoiltransferasa). En el caso de sujetos con caries, se observó una mayor abundancia de proteínas relacionadas con sistemas PTS, transportadores de disacáridos y N-acetilglucosamina-6-fosfato desacetilasa, sugiriendo mejores capacidades para explotar los azúcares disponibles y su fermentación. En cuanto a las 127 proteínas humanas encontradas y cuantificadas, también se encontraron diferencias en abundancia entre personas sanas y enfermas, incluyendo proteínas relacionadas con epitelio queratinizado, proteínas de respuesta inmune del huésped, metabolismo de hierro y proteasas e inhibidores de proteasas entre otros. Teniendo en cuenta las diferencias observadas, se intentó buscar aquellas proteínas que permitieran diferenciar a personas sanas de las enfermas. En principio, mediante la aplicación de una prueba univariante de T, se encontraron 53 proteínas bacterianas y 29 humanas, lo cual es muy prometedor, pero probablemente inviable para su aplicación en un test diagnóstico comercial. Por ello se aplicó un análisis multivariante (Trevino & Falciani 2006)? para poder detectar el mínimo número de proteínas que fueran capaces de diferenciar si una muestra procede de un individuo con o sin caries de la forma más fiable posible. Así se obtuvo un conjunto de 6 proteínas bacterianas y 4 humanas, capaces de diferenciar entre sanos y enfermos con una especificidad y sensitividad superior al 96%. Futuros estudios deberán confirmar la validez de estas proteínas para diagnosticar de forma temprana el riesgo de padecer caries, con el fin de poder establecer medidas preventivas antes de la aparición de signos clínicos de esta enfermedad.
