Resumen de Estudi del lloc d'unió del sodi de la permeasa de melibiosa d'Escherichia coli
Meritxell Granell Puig
La permeasa de melibiosa (MelB) és un cotransportador de la membrana d'Escherichia coli que transporta activament disacàrids (ex. melibiosa) utilitzant com a font d'energia un gradient transmembrana de Na +, Li + o H +. S'ha proposat una estructura de 12 α-hèlix transmembrana amb el costat N- i C-terminal a la cara citoplasmàtica. Estudis anteriors han proposat que el lloc d'unió dels cations dins la permeasa estaria formant per els quatre residus aspàrtics: D19, D55, D59 i D124. S'ha observat que la mutació de qualsevol d'aquests aspàrtics a cisteïna impedeix el transport de sucre acoblat a sodi. No obstant això, no s'ha realitzat estudis de la interacció d'aquests mutants amb el sodi i per tant la participació d'aquest aspàrtics en el lloc d'unió del catió és encara provisional. En aquest treball s'ha estudiat la implicació d'aquest residus aspàrtics en el lloc d'unió dels cations. S'ha expressat, purificat i reconstituït en liposomes els mutants D19C, D55C, D59C, D124C, i D59E. El mutant N58C també s'ha preparat i estudiat, ja que d'acord amb altres estudis de l'asparagina 58 també pot estar implicada en la unió del catió. S'ha utilitzat la tècnica d'espectroscòpia infraroja amb reflexió total atenuada que permet obtenir informació sobre l'efecte de la mutació en la interacció dels cations i/o la melibiosa amb la MelB.S'han realitzat espectres de diferència que s'han obtingut al fer passar una solució amortidora amb o sense substrat alternativament (per exemple, Na + i / o melibiosa), el procés s'ha realitzat repetidament. Els canvis en els espectres de diferència seran deguts a la interacció de la MelB amb el substrat. A causa del gran nombre de vibracions d'una proteïna que es poden observar per espectroscòpia d'infraroig, gairebé qualsevol interacció del substrat amb la MelB serà detectada per aquesta tècnica. Hem demostrat que els mutants D55C, D59C, D59E i N58C no interactuen amb Na+, ni en absència ni en presència de melibiosa. Per aquesta raó, proposem que aquests residus són lligands del Na+. D'altra banda, els mutants D19C i D124C preserven la capacitat d'interactuar amb el Na+, encara que el D124C presenta una menor intensitat en l'espectre de diferència degut a la interacció del sodi amb aquest mutant. Per tant, D19 no està involucrat en el lloc d'unió de Na+, en contrast amb els models anteriors, mentre D124 podria ser un lligand secundari responsable de l'acoblament catió-sucre. Finalment, dels mutants estudiats només D55C i D59C conserven la capacitat d'interaccionar amb la melibiosa, encara que amb algunes diferències respecte WT. Hem integrat tots aquests resultats experimentals en un model molecular de MelB, proposant un nou lloc d'unió del catió.
