Resumen de Estudio de una superfamilia de genes de respuesta a patógenos (repat) en insectos
Gloria Navarro Cerrillo
El intestino de los insectos es una de las principales vías de entrada de entomopatógenos. Con el fin de minimizar los efectos negativos de los patógenos, el intestino de los insectos posee diferentes mecanismos: síntesis de péptidos antimicrobianos, producción de especies reactivas de oxígeno, activación de los sistemas de reparación y detoxificación, melanización, fagocitosis, apoptosis y la renovación celular, entre otros. Estudios de expresión tras la exposición a diferentes patógenos han mostrado cómo la expresión de ciertos genes varía en el intestino tras la infección. Previamente a la realización de esta tesis, se identificó, en el lepidóptero Spodoptera exigua, una familia de genes que aumentaba sus niveles de expresión en el intestino tras la exposición a la toxina Cry1Ca de Bacillus thuringiensis y a baculovirus. Esta familia, compuesta por cuatro miembros en su inicio, se denominó repat (por respuesta a patógenos). Al comienzo de esta tesis no se disponía de información sobre el papel de estos genes en la respuesta a patógenos. Es por ello que el objetivo principal de esta tesis ha consistido en profundizar en el conocimiento sobre la familia REPAT, tanto en el estudio de su función a nivel molecular como en determinar sus implicaciones en la respuesta del intestino de los insectos a distintos microorganismos entomopatógenos y sus factores de virulencia. En un primer capítulo, la comparación a nivel transcripcional entre una población de S. exigua susceptible y otra resistente, a un producto comercial basado en B. thuringiensis (XentariTM), mostró una elevada expresión constitutiva de cuatro genes repat en la población resistente. Tres de estos genes repat eran nuevos, se secuenciaron y se nombraron como repat5, repat6 y repat7. Además, se observó una correlación positiva entre la expresión de repat5 y la resistencia al producto XentariTM. En un segundo capítulo tratamos de aproximarnos a la función molecular de estos genes a través del estudio de las proteínas que interaccionan con REPAT1 mediante la técnica del doble híbrido. Para ello se construyó una genoteca que contiene los genes que se expresan en el intestino de larvas de quinto estadio de S. exigua. En los experimentos de doble híbrido en levaduras se observó que dos proteínas interaccionaban con REPAT1. Estas proteínas eran REPAT4 y una nueva proteína similar a ésta, que se secuenció y se nombró como REPAT8. En estudios de localización celular se observó que REPAT1 se encuentra en el citoplasma celular, pero en presencia de REPAT8 aparece también en el núcleo. El análisis de la expresión de los ocho genes descritos hasta el momento mostraron una respuesta general a los tratamientos relacionados con B. thuringiensis (toxina Cry1Ca, XentariTM y una cepa de B. thuringiensis que no produce toxinas Cry, Bt cry-) y no frente a otros tratamientos con bacterias no patógenas (Escherichia coli, Enterococcus spp. y otras presentes en su microbiota), sugiriendo que la expresión de estos genes se activa principalmente en respuesta al daño celular. En un tercer capítulo, aprovechando la reciente secuenciación del transcriptoma de S. exigua por parte de nuestro grupo, tratamos de identificar nuevos genes repat. El análisis del trancriptoma reveló la presencia de al menos 46 miembros diferentes. El análisis de estas secuencias mostró la presencia de ciertos motivos conservados, así como la posible clasificación de sus miembros en dos grandes clases: ?REPATs y ?REPATs. Además, en este capítulo estudiamos la expresión de esta superfamilia de genes, observando un cambio en la expresión en intestino de los ?repats tras la intoxicación con Cry1Ca pero no en respuesta a un aumento de la microbiota en el intestino de las larvas. Interesantemente, al estudiar la expresión de estos genes en las células madre del intestino (en comparación a la expresión en el intestino completo), las larvas con mayor carga bacteriana mostraron un mayor número de genes repat expresados en estas células madre. El aumento del número de genes repat en S. exigua ha permitido la identificación de homólogos en otras especies de insectos: Spodoptera frugiperda, Spodoptera littoralis, Spodoptera litura, Mamestra configurata, Mamestra brassicae, Helicoverpa armigera, Bombyx mori y en el díptero Drosophila melanogaster. En el organismo modelo D. melanogaster se identificaron dos homólogos: CG13323 y CG13324. Dado que en Drosophila existen herramientas moleculares no disponibles para S. exigua, se decidió estudiar la función de estos homólogos para profundizar en el conocimiento de estos genes. Para ello se obtuvo, tanto un mutante con la deleción de CG13323 y CG13324, como mutantes de sobreexpresión de CG13323. El mutante con ambos genes delecionados mostró un aumento en la supervivencia a la infección con Pseudomonas entomophila, lo cual resultó contrario al resultado esperado, ya que los genes han mostrado aumento de su expresión después de la infección. También se observó un aumento en la supervivencia, tanto de larvas como de adultos, en los mutantes que sobreexpresan CG13323. Para comprobar si CG13323 estaba implicado en alguna de las rutas del sistema inmune de D. melanogaster, se estudió la expresión de algunos genes marcadores (diptericina de la ruta Imd, upd3 de la ruta JAK-STAT y vein de la ruta EGF), no encontrándose ningún cambio relacionado con la sobreexpresión de CG13323 que nos permitiera situar los genes repat en algunas de las principales rutas del sistema inmune de insectos. Debido a las características de los genes repat y las proteínas que codifican: la gran cantidad miembros de la misma familia, su diferente respuesta a nivel de expresión, el pequeño tamaño de las proteínas, la interacción entre miembros de la misma familia que produce su translocación nuclear, y la homología de alguno de sus miembros a factores transcripcionales como es MBF2, sugieren la posibilidad de que diferentes combinaciones de proteínas REPAT podrían ser responsables de la regulación de la transcripción de genes implicados en distintos aspectos de la fisiología del insecto.
