Investigación en terapias específicas de mutación en enfermedades metabólicas hereditarias. Respuesta a cofactores y terapia antisentido

• Autores: Cristina Aguado Esteban
• Directores de la Tesis: Lourdes Ruiz Desviat (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2008
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Fernando Valdivieso Amate (presid.), L. A. Pérez Jurado (secret.), Jorgina Satrústegui Gil-Delgado (voc.), José Fernández Piqueras (voc.), Aurora Martínez Ruiz (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Genética bioquímica
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen

  • Existen más de 500 enfermedades metabólicas hereditarias (EMH) con una frecuencia individual baja pero que en su conjunto afectan a un grupo significativo de la población. Solamente el 12% de estas patologías presenta un tratamiento eficaz por lo que se hace necesaria la búsqueda de nuevas terapias, entre ellas se encuentran aquellas basadas en el efecto que cada mutación produce a nivel de proteína, ADN ó ARN. En el presente trabajo hemos analizado varias de estas nuevas terapias, en concreto hemos investigado los mecanismos responsables de la respuesta a cofactores en fenilcetonuria (PKU), acidemia propiónica (AP), metilcrotonilglicinuria (MCG) y acidemia metilmalónica (AM) y hemos ensayado terapias moduladoras de splicing en AP.

    La fenilcetonuria está causada por defectos en la enzima fenilalanina hidroxilasa que cataliza la hidroxilación de la L-Phe, en esta reacción interviene la tetrahidrobiopterina (BH4) como cofactor, el tratamiento clásico de la enfermedad es la restricción protéica, pero desde hace 9 años se han descrito pacientes con una respuesta favorable a la suplementación oral con BH4. En este trabajo hemos genotipado 31 pacientes PKU españoles sometidos a test de sobrecarga con BH4 y hemos seleccionado 14 mutaciones missense para analizar sus propiedades cinéticas o de estabilidad utilizando diferentes sistemas de expresión, procariotas (E. colli), eucariotas(Hep3B) y libres de células (TNT). Los resultados nos han permitido identificar actividad residual en las proteínas analizadas cinéticamente, un mutante de Km por BH4 (D129G), tres proteínas estabilizadas por niveles elevados de BH4 (A309V, V388M e Y414C) y un aumento en la vida media de la PAH endógena en Hep3B al aumentar la BH4 pero sin ningún efecto a nivel transcripcional. La base molecular de la respuesta a BH4 es multifactorial y dependiente de mutación, apuntando a un efecto estabilizante de la BH4, como mecanismo mayoritario.

    La acidemia metilmalónica está causada por un defecto en el paso de metilmalonil CoA a succinil CoA catalizado por la enzima metilmalonil CoA mutasa (MCM) que utiliza como cofactor la Adocbl. Una de las enzimas responsables de la activación de la Adocbles la ATP: cobalamina adenosil transferasa (ATR), algunos pacientes con defectos en ATR responden positivamente a la suplementación con cobalamina. Para analizar los mecanismos moleculares responsables de esta respuesta se expresó en un sistema procariota la ATR y se midieron las propiedades cinéticas y la distribución oligomérica de mutaciones presentes en pacientes respondedores. Los resultados sugieren un defecto en la estabilidad de una de las proteínas mutante con una actividad enzimática reducida pero sin defectos en la afinidad por los sustratos.

    La acidemia poriónica y la metilcrotonilglicinuria son dos EMH causadas por defectos en carboxilasas mitocondriales y biotina dependientes (PCC y MCC respectivamente), no existe consenso en la literatura sobre el efecto de la biotina a nivel de ARNm de las carboxilasas, por ello analizamos el efecto de niveles farmacológicos y deficientes de biotina sobre estas dos carboxilasas en un modelo eucariota celular (Hep3B), observándose que la biotina no afecta la expresión de estas enzimas pero si favorece la conversión de apocarboxilasa a holocarboxilasa.

    Finalmente analizamos el efecto de drogas y de oligonicleótidos antisentido tipo morfolinos (AMOs) sobre mutaciones de splicing en pacientes con AP. El uso de tres drogas, valproico, bhutirato sódico y kinetina sobre fibroblastos de pacientes con mutacionesw que producen skipping exónico pero con niveles detectables de ARNm normal no produjo un aumento de los niveles de transcrito normal.

    Se usaron AMOs sobre dos pacientes con AP que portaban defectos intrónicos que generaban inserción de secuencias aberrantes, en estas secuencias insertadas se producía un incremento en los scores de splicing o una generación de motivos de unión por factores de splicing. Los AMOs fueron diseñados contra las secuencias de splicing crípticas de los pseudoexones para bloquear el acceso de la maquinaria de splicing.

    Usando la terapia antisentido sobre fibroblastos de los dos pacientes hemos obtenido el splicing correcto del ARNm y recuperación total de la actividad PCC. La inclusión de secuencias aberrantes es la causa de la enfermedad en estos pacientes y el uso de AMOs es una estrategia efectiva para este tipo de mutaciones.