Expresión intracelular de anticuerpos recombinantes en escherichia coli
- Autores: Paola Jurado Pérez
- Directores de la Tesis: Víctor De Lorenzo Preiteo (dir. tes.), Luis Ángel Fernández Herrero (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2004
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Miguel Vicente Muñoz (presid.), Fernando Rojo de Castro (secret.), Serge Muyldermans (voc.), Miguel Ángel de Pedro (voc.), Luis Álvarez Vallina (voc.)
- Materias:
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- Resumen
El objetivo de este trabajo es generar un sistmma, en bacterias gram negativas, capaz de producir anticuerpos intracelulares funcionales (intracuerpos).
Pretendemos además, dirigiendo la unión de algunos de estos anticuerpos hacia proteínas concretas, ser capaces de modular un mecanismo fisiológico dentro de la célula.
La producción de anticuerpos intracelulares en cepas de E. coli silvestres da lugar a anticuerpos no funcionales. Esto se debe a la imposibilidad de que se formen, en el ambiente reductor del citoplasma, los enlaces disulfuro que contienen los anticuerpos. La formación de estos enlaces es necesaria para el plegamiento y la actividad de la mayoría de los dominios inmunoglobulina (Ig). En este trabajo se investiga la formación de puentes disulfuro y la funcionalidad de los anticuerpos monocadena (scFv), en el citoplasma de estirpes de E. coli con mutaciones en genes que forman parte los dos principales sistemas intracelulares de reducción de enlaces disulfuro (la ruta de las tiorredoxinas, y la de las glutarredoxinas). Se ha examinado asimismo el efecto de la coexpresión de diferentes chaperonas de puentes disulfuro, en trans o fusionadas al scFv. Los resultados de esta tesis demuestran que la forma más eficiente de producir intracuerpos funcionales, con puentes disulfuro en sus dominios Ig, tiene lugar en cepas mutantes en los genes que codifican a la tiorredoxina reductasa (trxB) y la glutation oxidorreductasa (gor) en las cuales el scFv se produce fusionado al extremo C-terminal de la tiorredoxina 1 (Trx1).
Hemos transformado una cepa trxB gor con genotecas de fragmentos de DNA, que codificin a diferentes colecciones de scFvs, con la intención de buscar anticuerpos capaces de inhibir o activar un proceso de transcripción desde un promotor concreto. En estas búsquedas hemos encontrado varios anticuerpos capaces de activar o de inhibir el mecanismo de transcripción desde un promotor dependiente del factor
