Resumen de Role of canonical Wnt signaling in osteoclast bone resorption

Paula Ruiz Martín

• español

  Introducción El remodelado óseo es el resultado de un balance entre la formación y la resorción de hueso, en el que los osteoblastos y osteoclastos están implicados respectivamente. Los primeros provienen de progenitores mesenquimales de la médula ósea, mientras que los osteoclastos derivan de progenitores hematopoyéticos. Los osteoclastos necesitan de factores para su proliferación y diferenciación como son el factor estimulante de colonias de macrófagos (MCSF) y el ligando activador del receptor de NFkB (RANKL), ambos producidos por precursores osteoblásticos. Este último, actúa uniéndose a su receptor RANK en la superficie de los osteoclastos. Además de RANKL, los osteoblastos producen osteoprotegerina (OPG), que actúa uniéndose a RANKL, evitando que pueda unirse a su receptor y por tanto inhibe la diferenciación osteoclástica.

  Durante la última década se ha puesto de manifiesto la importancia de la vía de Wnt en la regulación de la masa ósea. Varios grupos de investigación descubrieron que diversas enfermedades óseas de carácter genético guardan relación con alteraciones directas o indirectas en la vía Wnt/β-catenina.

  Alteraciones de LRP5 El síndrome osteoporosis-pseudoglioma es una enfermedad rara autosómica recesiva consistente en anomalías oculares y osteoporosis, cuya causa es una mutación inactivadora del gen codificador de LRP5 [1]. La LRP5 en el ser humano se comporta como co-receptor de Frizzled para dos tipos de ligandos, uno de los cuales está constituido por las proteínas Wnt. También se han descrito mutaciones del LRP5 en algunos casos (infrecuentes) de osteoporosis juvenil idiopática [2], y se ha demostrado que variantes comunes de la LRP5 contribuyen a la variabilidad de la DMO en la población normal [3]. Así mismo, los ratones KO para LRP5 desarrollan osteoporosis postnatal [4].

  Se han descrito igualmente mutaciones activadoras, raras, de LRP5 [5]. En este caso se observa un aumento de masa ósea ("síndrome de masa ósea alta familiar") que puede considerarse un trastorno esclerosante, si bien puede resultar más discutible calificarlo de enfermedad propiamente dicha, puesto que en general no parece suponer un detrimento para la salud, sino más bien ser un factor protector frente al desarrollo de fracturas (no obstante, se han descrito alteraciones neurológicas por compresión en algunas situaciones [6]).

  Sin embargo, en los últimos años se ha iniciado un debate sobre la trascendencia de LRP5 ósea, frente a la de las células enterocromafines duodenales. La razón es que esta última sería responsable de la secreción de serotonina, la cual a su vez ejercería un efecto inhibidor sobre el hueso [7]. Por tanto, el papel de la señalización Wnt/βcatenina en la homeostasis del hueso no está totalmente claro.

  Desarrollo Teórico Vía canónica Wnt/β-catenina La vía Wnt es una vía de señalización celular muy conservada en la escala filogenética. No es en absoluto exclusiva del hueso, sino que más bien debe considerarse ubicua, interviniendo en procesos tan trascendentes como la embriogénesis, la organogénesis y la oncogénesis [8]. Su activación puede llevarse a cabo por rutas diferentes, una de las cuales (la que implica a la β-catenina), se denomina “canónica”, y las demás, en conjunto, “no canónicas”.

  En la vía canónica de Wnt, la unión de los ligandos Wnt al receptor Frizzled (Fz) y al co-receptor Lrp5, provoca la activación de la proteína disheveled (Dsh) y la posterior desestabilización del complejo proteico formado por Axin, APC y GSK3-β. Axin es reclutado y fosforilado por Lrp5 y por tanto β-catenina no puede ser fosforilada por GSK3-β, acumulándose en el citoplasma y translocándose al núcleo donde se une a los factores de transcripción TCF y LEF1, lo que activa la transcripción de los genes diana de Wnt.

  Por el contrario, en ausencia de proteínas Wnt, el receptor Frizzled y el co-receptor Lrp5 están inactivos y, por lo tanto, no pueden activar la proteína Dsh y el complejo proteico citoplasmático se estabiliza. Esto promueve la fosforilación de β-catenina mediante GSK3-β y esta fosforilación marca a la β-catenina para su degradación proteasomal, lo que impide que los genes diana de Wnt se transcriban. El receptor de los ligandos Wnt está constituido por dos elementos: una proteína “frizzled” y su co-receptor LRP5 ó 6. Existen diversos antagonistas de este receptor: la esclerostina, que se une al co-receptor LRP5/6; las proteínas de la familia Dickkopf (Dkk1), también capaces de unirse al co-receptor LRP5/6; o las proteínas solubles tipo frizzled, que actúan como señuelos que se fijan a los ligandos Wnt. El receptor de Wnt está conectado al complejo proteico inactivador de la β-catenina a través de la proteína Dsh.

  El papel de la señalización Wnt/βcatenina se ha estudiado mediante multitud de experimentos de ganancia y pérdida de función en animales experimentales. Como es el caso del gen de la β-catenina que se ha delecionado en los precursores mesenquimales, lo que resulta en la inhibición de la diferenciación osteoblástica favoreciendo la diferenciación condrogénica [9]. La ganancia de función de β-catenina en osteoblasto temprano lleva a un aumento de osteoblastogénesis, produciendo un aumento de masa ósea. Por otro lado, la ganancia de β-catenina en el osteoblasto maduro provoca un incremento de masa ósea debido al aumento de OPG, lo que lleva a una disminución del número de osteoclastos. Esto nos sugiere que un aumento de la señalización Wnt/βcatenina en el osteoblasto conduce a un aumento de la osteoblastogénesis y una disminución de la osteoclastogénesis, lo que resulta en un incremento de masa ósea. Por el contrario, una inhibición de dicha señalización lleva a una disminución de osteoblastogénesis y masa ósea [10].

  Vía Wnt/β-catenina y osteoclastos Los estudios comentados arriba, nos han permitido conocer los efectos de la vía canónica de Wnt en las células de linaje osteoblástico. Sin embargo, el hecho de que la vía Wnt/β-catenina sea ubicua, indica que debe estar presente también en los osteoclastos, y resulta sorprendente que apenas se haya considerado la posibilidad de que su alteración en esta célula repercuta sobre la masa ósea. Por lo que un mayor conocimiento de la función de la señalización de Wnt en la biología del hueso, requiere el análisis de su posible papel en estas células.

  La presencia de la vía de señalización Wnt/β-catenina en los osteoclastos ha sido descrita por Qiang et al. en un estudio realizado en pacientes con mieloma [11]. En él han comprobado en los osteoclastos la expresión de los genes de varios componentes de la vía (Wnt, Frizzled, LRP y TCF), la acumulación de β-catenina en respuesta a la proteína Wnt3A o al litio (inhibidor de la proteína GSK-3β), la inhibición de esta respuesta en presencia de antagonistas como Dkk-1 o sFRP1, y la inducción de la actividad transcripcional TCF/LEF por Wnt3A. Modarresi et al [12] han descrito que el ritonavir, un fármaco utilizado en el tratamiento de los enfermos con infección por VIH y responsable, al menos en parte, de la pérdida de masa ósea que sufren estos pacientes, suprime en los osteoclastos genes implicados en la vía canónica de Wnt y bloquea la translocación nuclear de la β-catenina. Estos mismos autores han observado que la exposición al cloruro de litio de precursores de los osteoclastos, así como la sobre-expresión de β-catenina mediada por adenovirus, suprime su diferenciación.

  Recientemente, Wei et al. [13] han abordado el problema desarrollando modelos murinos de deleción génica condicional de β-catenina en células de linaje osteoclástico. Dos de los modelos utilizan la cre recombinasa bajo control de los genes de la Lisozima M y la Catepsina K. Los autores encuentran una disminución del hueso trabecular de la tibia, expresado como BV/TV (volumen óseo/volumen total) medido por μCT. No se proporcionan detalles respecto al hueso cortical, ni respecto a otros huesos (vértebras). El escaso número de trabajos que se han ocupado de analizar el efecto de la vía Wnt/βcatenina osteoclástica sobre la masa ósea nos ha movido a estudiar el papel de la misma en el osteoclasto maduro. Este es el objetivo de la presente Tesis Doctoral.

  Resultados Para ello, hemos utilizado como modelo experimental ratones en los que mediante la utilización de la Cre recombinasa, se ha delecionado β-catenina de forma condicional en células Catepsina K (CtsK) positivas, ya que ésta es considerada una enzima específica de los osteoclastos en sus últimas etapas de maduración. Además del análisis fenotípico general y esquelético, se examinó en cultivos in vitro de osteoclastos el efecto de WNT3A en la supervivencia de los mismos. Los resultados de estos análisis en nuestros animales experimentales (Ctnnb1lox(2-6)/lox(2-6);CtsKCre) pusieron de manifiesto a las 12 semanas de edad una intensa pérdida de hueso, tanto cortical como trabecular, que se desarrolla progresivamente desde las 4 semanas. Además, pusieron de manifiesto que la señalización Wnt/βcatenina favorece la apoptosis de los osteoclastos tanto en cultivos desarrollados a partir de células de la médula ósea de ratones de la línea LisozimaM (LysMCre) como de células procedentes de ratones CtsKCre. Pudimos comprobar también, una disminución de la expresión de Opg en el hueso de los animales experimentales, lo que sugiere que los osteoclastos, con independencia de la alteración funcional determinada en ellos por la deleción de β-catenina, estaban siendo estimulados en su función resorbedora desde el exterior, por células ajenas a ellos. Ello nos llevó a estudiar la expresión de CtsK en otras células óseas, encontrando células de estas características en la capa interna del periostio. Estas células coinciden en expresión con Colágeno tipo 1, lo que sugiere que dichas células pertenecen al linaje osteoblástico.

  Conclusión Por lo tanto, nuestros resultados indican que la pérdida ósea observada en los ratones Ctnnb1lox(2-6)/lox(2-6);CtsKCre se debe tanto a un mecanismo autónomo-celular de los propios osteoclastos, como a un efecto indirecto mediado por células de estirpe osteoblástica mediante OPG.

  Palabras clave: Hueso, βcatenina, osteoclastos, CatepsinaK, Vía canónica de Wnt Bibliografía:

  1.- Gong et al. LDL Receptor-Related Protein 5 (LRP5) Affects Bone Accrual and Eye Development Cell 2001;107:513–523.

  2.- Hartikka H, Makitie O, Mannikko M, Doria AS, Daneman A, Cole WG, et al. Heterozygous mutations in the LDL receptor-related protein 5 (LRP5) gene are associated with primary osteoporosis in children. J Bone Miner Res. 2005;20:783–9 3.- Riancho et al. Wnt receptors, bone mass, and fractures: gene-wide association analysis of LRP5 and LRP6 polymorphisms with replication. Eur J Endocrinol. 2011;164:123-31 4.- Kato et al Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor.;J Cell Biol 2002;157:303-14 5.- Boyden et al. High bone density due to a mutation in LDL-receptor–related protein 5 NEJM 2002;346:1513.

  6.- Whyte et al. High-Bone-Mass Disease and LRP5. NEJM. 2004;350:2096-98 7.- Yadav et al. Lrp5 controls bone formation by inhibiting serotonin synthesis in the duodenum. Cell 2008;135:825–837 8.- Clevers H. Wnt/β-Catenin Signaling in Development and Disease. Cell 2006;127:469-480.

  9.- Hill TP, et al. Canonical Wnt/beta-catenin signaling prevents osteoblasts from differentiating into chondrocytes. Dev.Cell 2005;8:727-38 10.- Glass DA, et al. Canonical Wnt signaling in differentiated osteoblasts controls osteoclast differentiation. Dev.Cell 2005;8:751-64 11.- Qiang YW et al. Characterization of Wnt/beta-catenin signalling in osteoclasts in multiple myeloma. Br.J Haematol. 2010;148:726-38 12.- Modarresi R et al. WNT/beta-catenin signaling is involved in regulation of osteoclast differentiation by human immunodeficiency virus protease inhibitor ritonavir: relationship to human immunodeficiency virus-linked bone mineral loss. Am.J Pathol. 2009;174:123-35 13.- Wei W, Zeve D, Suh JM, Wang X, Du Y, Zerwekh JE, Dechow PC, Graff JM, Wan Y. Biphasic and dosage-dependent regulation of osteoclastogenesis by β-catenin. Mol Cell Biol. 2011;31:4706-19.

• English

  It is well known that activation of Wnt/βcatenin signaling in the osteoblast lineage leads to an increase in bone mass increasing osteoblastogenesis and decreasing osteoclastogenesis. However, the role of this pathway on the osteoclast lineage has been understudied. Here, we examined the effects of Wnt/βcatenin signaling in mature osteoclasts by generating mice lacking βcatenin in CathepsinK-expressing cells. These mice developed a severe low-bone-mass phenotype associated with an excessive number of osteoclasts. We found that WNT3A promoted osteoclast apoptosis and therefore, attenuated the number of osteoclasts in vitro. This reveals a cell-autonomous effect of Wnt/βcatenin signaling in the lifespan of osteoclasts. Furthermore, Osteoprotegerin expression was dramatically decreased indicating an additional external activation of osteoclasts. Accordingly, CathepsinK expression was detected in TRAP-negative cells of the inner periosteal layer also expressing Collagen1. Our results indicate that the bone phenotype found in our animals combines a cell-autonomous effect with indirect effects of osteoblastic cells.