Esta tesis, presentada para obtener el título de Doctor en Física, es el resultado del trabajo de investigación que llevé a cabo dentro de grupo de investigación de Nanomateriales y Materia Blanda del Departamento de Física de la Materia Condensada de la Facultad de Física de la Universidad de Santiago de Compostela. El trabajo de investigación fue dirigido por el Dr. Julio R. Rodríguez González, Catedrático de esta Universidad.
El trabajo aquí expuesto describe la caracterización fisicoquímica del proceso de compactación de ácido desoxirribonucleico (ADN) mediado por policationes y liposomas catiónicos, así como la posterior transfección de los complejos formados hacia células eucariotas.
La tesis se divide en 7 capítulos. En el capítulo 1 presenta una introducción general al tema. El capítulo 2 presenta una descripción de los materiales y métodos empleados. Los capítulos 3, 4, 5 presentan los resultados obtenidos de la caracterización del quitosano, del cloruro de poli(dialil-dimetil-amonio) (pDADMAC) y del Metafectene Pro (MEP) como vectores de ADN, respectivamente. El capítulo 6 se ocupa de las conclusiones generales extraídas. Y finalmente, el capítulo 7, presentado como un apéndice, expone los resultados obtenidos después de una cooperación de nuestro grupo con el grupo de investigación dirigido por el Prof. Björn Lindman de la Universidad de Lund en relación con la liberación inducida por ciclodextrinas de ADN de complejos ADN-tensioactivo, un tema que está estrechamente relacionada con el tema de esta tesis.
1.INTRODUCCIÓN El ADN ha sido centro de muy especial atención por los investigadores desde el descubrimiento de su función como portador de información genética. Miles de genes han sido identificados hasta la fecha en el marco de El Proyecto Genoma Humano (PGH). El PGH, fundado en 1990 bajo la dirección de James D. Watson, es un proyecto internacional de investigación científica con el objetivo fundamental de determinar la secuencia de pares de bases químicas que componen el ADN e identificar los aproximadamente 20,000-25,000 genes del genoma humano desde un punto de vista físico y funcional. Este proyecto ha abierto por tanto enormes posibilidades para la medicina; esto es, se ha suscitado una nueva era en la prevención, diagnóstico, tratamiento y curación de las enfermedades.
Muchos investigadores consideran la terapia génica como la terapia del siglo 21. La identificación de mutaciones génicas causantes de enfermedades es una rica fuente de oportunidades para la identificación de nuevos tratamientos de la enfermedad. Después de identificar una mutación y su enfermedad asociada, la comunidad científica estudia la forma y funciones biológicas del correspondiente producto génico alterado (ordinariamente proteína). Con esta información en la mano, se persiguen en la actualidad tres enfoques terapéuticos principales basados en los genes: -Terapia con células madre: Se utilizan células madre humanas para reparar el tejido dañado por la enfermedad.
-Terapia de modificación de ARN: El ARNm codificado por un gen mutado se dirige a la célula objetivo.
-Transfección: Segmentos de ADN modificado son dirigidos a la célula objetivo.
Transfección (también conocido como liberación de genes) La transfección se basa en el simple concepto de que si una enfermedad es causada por el mal funcionamiento de un gen, dicha enfermedad puede ser revertida por la adición de copias del mismo gen en buen estado de una fuente externa. A pesar de esta simple concepción, el mecanismo de la transfección sigue sin estar claro hasta la fecha. Mientras que los primeros modelos prevén la fusión del complejo ADN-vector con las membranas celulares, recientemente, la mayoría de los investigadores creen que el complejo entra en las células por una vía endocítica.
Hasta ahora, se han utilizado dos estrategias en la liberación de transgenes (genes que se transmiten del genoma de una especie al genoma de otra): -Ensayos in vivo: El transgen es liberado directamente a las células, tejidos u órganos de un paciente afectado.
-Ensayos in vitro: Se requiere la extracción de una población celular del paciente afectado. Las células son alteradas genéticamente para expresar el transgen de interés y luego son trasplantadas de nuevo al paciente.
Los ensayos in vitro e in vivo requieren dos elementos fundamentales: i) un plásmido, que consiste del transgen de interés y algunas secuencias de ADN extra que permiten la expresión del gen en las células humanas, y ii) un vehículo para introducir el transgen en las células (denominado vector de transfección).
Aunque aparentemente los enfoques in vitro e in vivo representan biológicamente el mismo proceso, es conveniente describirlos por separado. En lo concerniente a la transfección in vivo, se han reportado una serie de métodos con distintos grados de éxito.
Estos métodos incluyen la inyección directa de plásmido en los músculos, la liberación de complejos ADN-proteína, la co-precipitación de ADN con fosfato de calcio, la encapsulación de ADN en diversas formulaciones lipídicas, y la infección utilizando vectores retrovirales clonados. Entre ellos, el uso de ADN desnudo sin ningún tipo de vector adherido constituye la estrategia más simple y la más segura. Sin embargo, la rápida degradación del ADN debida a ataques enzimáticos en la vecindad de la membrana celular, el nivel de expresión es, en general, considerablemente bajo.
Como se ha mencionado con anterioridad, la interacción del ADN con compuestos catiónicos en soluciones acuosas conduce a la formación de complejos químicos de especial importancia para la terapia génica. Dichos compuestos actúan como vehículos (vectores) para la transfección de ADN. Aunque los vectores de transfección más eficaces se basan en virus, sin embargo, adolecen de serias limitaciones tales como respuestas inmunológicas adversas del organismo receptor. Debido a su estabilidad en el almacenamiento, a su facilidad de producción y a su facultad de poder ser administrados en repetidas ocasiones con respuestas inmunológicas mínimas, los vectores de transfección no virales se han propuesto desde hace algunos años como única alternativa segura a los vectores de naturaleza vírica. Dos tipos principales de vectores no virales actualmente investigados en la actualidad son los polímeros- y lípidos-catiónicos.
Los polielectrolitos son polímeros con grupos ionizables que en disolventes polares tales como el agua o soluciones ácidas, se disocian dejando iones en la cadena polimérica y desprendiendo contraiones en la disolución. Al mezclarse en una misma disolución acuosa, los polielectrolitos con carga opuesta interactúan electrostáticamente y forman complejos. Este proceso es promovido por un aumento en la entropía del sistema debido a la liberación de contraiones. La transfección realizada con complejos ADN-polielectrolitos catiónicos se conoce como polifección. Los polímeros catiónicos más estudiados en la actualidad como vectores de transfección son el quitosano, la polietilenimina, la poli(L-lisina), los poli(beta-amino éster) y los dendrímeros de poliamidoamina.
Por su parte, la transfección mediada por lípidos catiónicos se conoce como lipofección. Antes de ser conducido a las células, el ADN se ve obligado a interactuar con liposomas, estructuras vesiculares formadas normalmente por una mezcla de un lípido neutro y un lípido catiónico. La ventaja de la lipofección sobre otras técnicas tales como la polifección, es que los liposomas constituyen herramientas útiles para ensayos preclínicos y clínicos debido a su biodegradabilidad, baja inmunogenicidad y a la facilidad con la que pueden ser producidos a gran escala. Además, de forma similar a los policationes (y contrario a los vectores de naturaleza vírica), los liposomas catiónicos tienen la capacidad de transferir ADN de tamaño ilimitado. Desafortunadamente, aparte de todas estas características favorables, se debe admitir que existen algunos inconvenientes inherentes a lipofección. Dichos incovenientes son: i) su eficacia es impredecible y depende de diferentes factores tales como la composición de los liposomas, las condiciones de preparación, el tamaño y la carga superficial, la vía de introducción del complejo hacia los cultivos celulares, y ii) la escasez de conocimiento de los aspectos fisicoquímicos envueltos en la interacción ADN-liposoma catiónico. En la literatura se describen cuatro conformaciones principales de los complejos ADN-liposoma catiónico (también llamados lipoplejos): una con una estructura lamelar de corto alcance compuesta por bicapas lipídicas planas y el ADN empaquetado entre ellas, otra donde las moléculas de ADN están encapsuladas dentro de una bicapa lipídica formando complejos cilíndricos que están empacados en una red hexagonal, una tercera donde las vesículas con carga positiva están interconectadas por moléculas extendidas de ADN, modelo conocido como collar de perlas, y finalmente otra en la que se sugiere que la molécula de ADN se compacta a una forma globular y se adhiere a la superficie externa de las vesículas con carga positiva. Lo que se puede concluir de los cuatro casos, cualquiera que sea la naturaleza de las interacciones, es que a concentraciones diluidas ningún cambio estructural se hace presente en los sistemas; es decir, no hay cambio aparente en la vesícula. Mientras que a concentraciones elevadas la situación se torna diferente en cuanto que las vesículas tienden a coalescer y flocular.
A pesar de la disparidad de criterios tocantes a las interacciones ADN-liposoma, existen en el mercado más de 50 kits comerciales para la transfección de ácidos nucleicos. Uno de estos productos es el Metafectene Pro. MEP es una formulación basada en una poliamina, un lípido catiónico. Como lípido neutro estabilizante, MEP contiene la dioleil-fosfatidiletanolamina (DOPE por sus siglas en inglés). MEP pertenece a una nueva clase de reactivos de transfección basados en la tecnología de acidólisis repulsiva de membrana (RMA por sus siglas en inglés). La tecnología RMA desarrollada por Biontex permite al ADN escapar del lipoplejo ADN-MEP una vez que éste es absorbido por el endosoma. El entorno ácido provoca que el MEP se separe de su carga. Las fuerzas de repulsión electrostática entre las diferentes partes de igual carga positiva del mismo MEP generan una rotura en la membrana del endosoma llevando en consecuencia a la liberación del material genético.
En el presente trabajo se han caracterizados como vectores de transfección de ADN dos familias de policationes (poliaminas), el quitosano y el cloruro de poli(dialil-dimetil-amonio) (pDADMAC), y además una formulación lipídica ampliamente utilizada a nivel mundial en ensayos de transfección, Metafectene Pro. Los estudios fueron realizados variando distintas condiciones experimentales tales como el pH, la estructura química y el peso molecular de los vectores catiónicos.
Para ello se emplearon una batería de métodos experimentales. Los métodos principales incluyeron la conductivimetría, movilidad electroforética, dispersión dinámica de luz, calorimetría isotérmica de titulación, microscopía de fuerza atómica, microscopía electrónica de transmisión, el crecimiento de células en cultivo y la expresión génica. Los métodos complementarios incluyeron las determinaciones de viscosidad, densidad, velocidad del sonido, etc.
En la formación de complejos se evaluó el efecto de la densidad de carga y valencia catiónica. Para los complejos ADN-vector fueron determinados seis parámetros: i) el radio hidrodinámico, RH, ii) su estabilidad con el tiempo, iii) la razón vector/ADN a la cual las interacciones electrostáticas tenían comienzo tanto para los complejos ADN-policatión como para el complejo ADN-liposoma, iv) el potencial Z, v) la energética de formación de los complejos, y vi) su morfología. En cuanto a la eficiencia de transfección, fueron ensayados para la expresión de beta-galactosidasa los complejos con características más prometedoras (es decir, partículas compactas con valores de potencial Z positivos).
2. RESULTADOS 2.1 ADN-quitosano: formación de complejos y eficiencia de la transfección Se estudiaron tres quitosanos de diferentes viscosidades (baja, media y alta) como vectores de ADN. Antes de la experimentación, se determinó peso molecular, Mw, de cada quitosano en base a la medida de viscosidades y por medio de la ecuación de Mark-Houwink. Los quitosanos fueron identificados de acuerdo con sus pesos moleculares y representados abreviadamente como C(689), C(1652) y C(2901) correspondiendo a los quitosanos de baja, media y alta viscosidad, respectivamente.
El estudio de los complejos ADN-quitosano se llevó a cabo en dos pasos. En primer lugar, la formación del complejo fue estudiada por dispersión dinámica de luz (DLS por sus siglas en inglés). El estudio se realizó con el objetivo de caracterizar el efecto del pH del medio y el peso molecular del quitosano (es decir, el efecto de la densidad de carga y valencia del quitosano) sobre las características estructurales de los complejos formados.
Asimismo, la calidad de todas las funciones de autocorrelación fue confirmada por el cálculo del factor de coherencia del instrumento, f. Los factores de coherencia calculados a partir de nuestros datos experimentales se encontraron en el rango de 0,746 ¿ f ¿ 0,790. Para las soluciones quitosano y ADN y las mezclas con N/P < 1, los factores de coherencia no se calcularon debido a la ausencia de línea base.
Se demostró que los complejos ADN-quitosano obtenidos son estables a partir de un valor mínimo de N/P, que denominamos (N/P)c, y que el pH y Mw influyen en el cociente N/P y en RH, respectivamente. Se encontró que cuanto más alto era el pH, mayor era la cantidad de quitosano necesaria para la formación del complejo, un efecto que fue especialmente pronunciado para el quitosano de más alto peso molecular C(2901).
Asimismo, se encontró que con el aumento de Mw, el tamaño de los complejos aumenta de forma lineal. En general, los complejos ADN-quitosano presentan tamaños estables y reproducibles estando RH en torno a los 190-250nm para N/P ¿ (N/P)c.
En segundo lugar, y con base en los resultados obtenidos del estudio de dispersión de luz que sugieren que a pHs ácidos la formación de complejos se torna favorable, se desarrolló una caracterización físico-química completa del proceso de formación de los complejos ADN-quitosano. Se determinaron los valores de potencial, energías de enlace y morfología de los complejos. Además, se evaluó de la eficiencia de la transfección de estos complejos.
Los complejos mostraron valores de potencial Z alrededor de 16 mV y un enlace de naturaleza entrópica. Esto último sugiere una asociación electrostática promovida por la liberación de contraiones durante el enlace. En cuanto a su morfología, TEM y AFM revelaron que los complejos adoptan una morfología de núcleo-coraza donde los glóbulos/agregados están rodeados por hebras que aparentemente salen del interior del complejo. En lo que se refiere a la transfección, la expresión beta-galactosidasa parece aumentar con la valencia del quitosano (masa molecular), sin embargo, las tasas de transfección de los complejos ADN-quitosano son notablemente inferiores en comparación con el complejo ADN-MEP. Considerando en conjunto la morfología de los complejos, sus valores de potencial Z marcadamente positivos y la baja eficiencia en la transfección, suponemos que en la morfología núcleo-coraza observada, la cadena ADN debe estar empacada en el interior del complejo siendo rodeada por las cadenas quitosano. Cabe mencionar que esta estructura ha sido reportada como muy recurrente en sistemas en los cuales el policatión (en este caso el quitosano) se encuentra presente en exceso con respecto al ADN.
2.2 ADN-pDADMAC: formación de complejos y eficiencia de la transfección Al igual que con el quitosano, se evaluó la influencia de la densidad de carga (cd) y la valencia del policatión pDADMAC en la formación de complejos y eficiencia de la transfección. Fueron estudiados cuatro homo-polímeros (cd = 1, con valencias diferentes) y un copolímero, poli(cloruro de acrilamida-co-dialil dimetil amonio) (coDADMAC) (cd <1, con valencia equivalente a uno de los homopolímeros). Para simplificar, los pDADMACs fueron identificados como p(1, <619), p(1, 929), p(1, 1703), p(1, 2786), y p(0,26, 668) donde el primer y segundo términos en el paréntesis denotan la densidad de carga y valencia, respectivamente.
Se detectaron dos razones características de pDADMAC en ADN. Experimentos de ITC y conductivimetría revelaron que la razón de compactación del ADN, (N/P)c, se rige principalmente por cd. Mientras tanto, según lo observado por las experiencias de DLS, la razón molar a la cual los complejos alcanzaron la mayor compactación (el menor tamaño) (N/P)*, fue determinada por la valencia del pDADMAC.
Al igual que los complejos ADN-quitosano, los complejos ADN-pDADMAC presentaron un enlace de naturaleza entrópica. Se formaron estructuras compactas y estables (RH ~ 100 nm) con valores de potencial Z positivos (~ 11 mV), pero bajas eficiencias de transfección en comparación con el lipoplejo ADN-Metafectene Pro. En la determinación de las eficiencias de transfección de estos complejos se volvieron a observar bajas expresiones de beta-galactosidasa, que de nuevo pueden ser atribuidas a una posible conformación núcleo-coraza en el complejo. Los complejos formados presentaron una estructura toroidal.
2.3 Formación de complejos ADN-MEP Con base en su alta eficiencia como vector de transfección hacia células eucariotas, MEP se utilizó como blanco positivo en ensayos de transfección de ADN. En comparación con la eficiencia de la transfección de los complejos ADN-quitosano y ADN-MEP, la eficiencia de la transfección del complejo ADN-MEP es marcadamente superior. Por ende, era de nuestro interés el caracterizar el proceso de formación de complejos ADN-MEP. Se llevó a cabo una caracterización físico-química de las interacciones ADN-MEP en torno a la relación de masa recomendada para la transfección (L / D = 700) a un pH de 6.5 (10 mM Bis-Tris) ya una temperatura de 25 º C.
Un marcado incremento en la intensidad de la luz dispersada por los complejos a valores (L/D)c aprox. 600 muestra que esta es la zona en la que comienzan a formarse los complejos. Este resultado valida la zona reportada por Biontex como la óptima para la realización de los estudios de transfección ((L/D) = 700). Los resultados de DLS demuestran que los complejos tienen un tamaño promedio de 135 nm y que se mantuvieron estables por al menos siete días. En lo que concierne a la morfología, AFM y TEM muestran complejos en acuerdo al modelo conocido como collar de perlas donde las vesículas parecen ser interconectadas por hebras de ADN. Finalmente y en nuestra opinión lo más importante, los resultados de potencial Z demuestran que la condición de isoneutralidad no es alcanzada por los complejos a las concentraciones a las cuales la transfección es satisfactoriamente implementada; es más, ellos presentan un potencial Z marcadamente negativo. Este resultado sugiere que la entrada al núcleo celular no es debida a un proceso de endocitosis exclusivamente, por lo que se especula que esta entrada del complejo a la célula puede estar mediada por un proceso de fagocitosis.
3. CONCLUSIONES GENERALES Y TRABAJO A FUTURO En la presente tesis los policationes quitosano y cloruro de poli(dialildimetilamonio) (pDADMAC) y el liposoma catiónico Metafectene Pro se estudiaron como vectores de ADN para terapia génica. Se siguieron e interpretaron los procesos de formación de complejos así como su transfección al interior celular. Se evaluaron las magnitudes importantes para el proceso de transfección, sus características estructurales, electroquímicas y energéticas, prestando especial atención al efecto de la densidad de carga (cd) y a la valencia de los policationes. La eficiencia de la transfección fue analizada en base a la expresión de la beta-galactosidasa.
3.1 Conclusiones generales Los sistemas ADN-quitosano y ADN-pDADMAC revelaron buenas propiedades coloidales y características fisicoquímicas muy similares uno con respecto al otro. Después de su interacción con ADN, ambos formaron complejos lo suficientemente pequeños como para ser captados la interior celular por endocitosis. Sin embargo, su eficiencia de transfección fue notablemente baja en comparación a la del lipoplejo ADN-MEP. Con los resultados experimentales que aquí se presentan se observa que ésta baja eficiencia de transfección encuentra explicación en la alta afinidad del enlace ADN-policatión, aunada con la conformación estructural que los poliplejos adoptan en solución.
Los hallazgos más importantes se enumeran a continuación.
A) Poliplejos ADN-quitosano Tres quitosanos de valencias diferentes (689, 1652, y 2901) fueron estudiados a tres valores de pH distintos, 5, 6 y 6.5 (tres distintas densidades de carga).
Los principales resultados dispersión de luz son los siguientes: 1) La densidad de carga del quitosano juega un papel importante en la formación de complejos de ADN. A pH 5 y 6 el cociente (N/P)c de todos los poliplejos fue inferior a 2 (como también fue demostrado por los resultados de conductividad, potencial Z e ITC). Sin embargo a un pH de 6.5 los poliplejos con quitosano de valencias 1652 y 2901 presentaron complejos compactos y estables sólo a (N/P)c ¿ 6. Esto se explica por el hecho de que a medida que el pH se acerca al pKa del quitosano, la neutralización de carga de los grupos amino da lugar a una mayor cantidad de quitosano necesaria para la formación de complejos con ADN.
2) Se encontró que el tamaño de los complejos está fuertemente relacionado con la valencia del quitosano, al tiempo que es independiente de su densidad de carga. Se demostró que el crecimiento del radio hidrodinámico con la valencia seguía una tendencia lineal, Los poliplejos formados con los quitosanos C(689), C(1652), y C(2901) presentaron tamaños de 187 +/- 21, 210 +/- 11, y 246 +/- 13 nm, respectivamente. La explicación a este fenómeno es que a medida que la masa molecular del quitosano aumenta, los complejos que forma con el ADN son menos solubles.
3) En lo que se refiere a la estabilidad de los complejos, para valores N/P = 6, éstos demostraron ser estables por un periodo de al menos 6 días.
Trabajar a pH bajo puede ser una ventaja debido a que se necesitan concentraciones más bajas de quitosano para compactar al ADN. En consecuencia, como un segundo paso en nuestro estudio, hemos caracterizado la influencia de la valencia del quitosano pero centrándonos ahora en la formación de complejos en condiciones de acidez (pH 5). Los métodos experimentales que hemos utilizado fueron la movilidad electroforética, ITC, AFM, TEM y ensayos de ONPG.
4) Todos los poliplejos, independientemente de la valencia del quitosano, dieron valores positivos de potencial Z en torno a los 16 mV y morfologías del tipo cepillo, como fue demostrado por los resultados de movilidad electroforética, TEM y AFM, respectivamente. Considerando en conjunto estos resultados podemos especular con la posibilidad de que los poliplejos adopten una estructura de núcleo-coraza típica de sistemas formados por polielectrolitos. Este modelo establece que el ADN se condensa en la parte interior del poliplejo mediante la unión de segmentos cortos de un gran número de cadenas de policatión, mientras que los segmentos restantes de estas mismas cadenas se espera que se encuentren libres en la parte externa del complejo dando lugar a cargas superficiales notablemente positivas.
5) La afinidad de enlace entre el ADN y el quitosano fue estudiada mediante calorimetria (ITC). Las constantes de enlace obtenidas fueron del orden de 10 E5 - 10 E6 y 10 E3 - 10 E4 1/M para el primer y segundo sitio de unión, respectivamente. Se encontró una tendencia decreciente de la constante K con la valencia. Este resultado refuerza nuestra hipótesis de que la valencia del quitosano dificulta hasta cierto punto la formación de complejos (como se muestra por la tendencia lineal de RH con Mw representado por DLS).
6) Verificamos que el proceso de enlace es exotérmico en todos los casos. Al momento que las cargas negativas del ADN iban siendo neutralizadas por las cadenas de quitosano se observó una disminución en el calor de enlace liberado. La zona de estabilización de calor liberado corresponde a la de la completa condensación del ADN. Los complejos formados por los quitosanos C(689) y C(1652) mostraron una (N/P)c ~ 0,5 mientras que para C(2901), (N/P)c ~ 1.
7) El proceso de enlace demostró tener una naturaleza entrópica. Este resultado es típicamente observado en interacciones electrostáticas de polielectrolitos donde el proceso es promovido por la liberación de contriones (deltaS1 ~ 0.2, and deltaS2 ~ 0.1 en todos los casos).
8) Finalmente, la tasa de transfección del complejo ADN-quitosano a las células HeLa se determinó mediante la expresión de la beta-galactosidasa. Se estudiaron complejos y nanoesferas con distintos valores de N/P. En general, la eficiencia de la transfección de los complejos (y nanoesferas) resultó ser muy inferior en comparación con la del lipoplejo ADN-MEP utilizado como control. La baja tasa de transfección se explica en virtud de los resultados de potencial Z, TEM y AFM (que sugieren la estructura núcleo-coraza), e ITC (que demuestra una alta afinidad de enlace).
B) Complejos ADN-pDADMAC Se analizaron cuatro homopolímeros DADMAC (cd = 1, con valencias diferentes) y un co-polímero, cloruro de poli(acrilamida-co-dialildimetilamonio) (coDADMAC) (cd <1 y valencia equivalente a uno de los homopolímeros).
1) Se observó que la densidad de carga es la propiedad que gobierna el cociente crítico (N/P)c. Los resultados de ITC, conductividad y potencial Z revelaron que los complejos formados a partir de los homopolímeros dan una razón molar (N/P)c de aproximadamente la mitad del correspondiente al coDADMAC (cd = 0.26). Este resultado está en concordancia con lo observado a partir de los complejos formados con quitosano.
2) Se encontró que el tamaño de los complejos está estrechamente relacionado con la valencia del pDADMAC, al mismo tiempo que es independiente de la densidad de carga. Los poliplejos formados con pDADMACs p(1, <619), p(1, 929), p(1, 1703), p(1, 2786), y p(0,26, 668) produjeron tamaños de 79.4 +/- 2.1, 87 +/- 6,9 y 108,9 +/- 12.5, 112.6 +/- 9.7 y 199.8 +/- 23.5 nm, respectivamente. Se confirma así la hipótesis de que hasta cierto punto la influencia de la densidad de carga se ve afectada por una disminución de la solubilidad cuando se trabaja con polímeros de alto peso molecular. De la misma forma, el hecho de que los complejos formados con p(0.26, 668) mostraran radios hidrodinámicos más altos en todo el intervalo de concentraciones puede explicarse por la presencia de la acrilamida en la cadena polimérica. La acrilamida tiene una alta capacidad hidrofílica.
3) Se observa una reducción en el tamaño de los complejos con el tiempo. Esta característica se acentúa con el incremento de la valencia del pDADMAC, debido a que aumenta flexibilidad de la cadena polimérica.
4) Todos los poliplejos, independientemente de la valencia y densidad de carga del pDADMAC, presentaron valores de potencial Z de alrededor de 12 mV y morfologías toroidales como se demostró mediante la movilidad electroforética y AFM, respectivamente. Una vez más se infiere una estructura núcleo-coraza con el ADN compactado en el interior del complejo.
5) En lo que se refiere a las contribuciones energéticas la formación de los complejos resultó ser de naturaleza entrópica y con una alta afinidad de enlace (al igual que en el sistema ADN-quitosano). Sin embargo, a diferencia del caso de los complejos ADN-quitosano, las contribuciones entálpicas para los complejos ADN-p(1, <619) y ADN-p(1, 929) se presentan con carácter endotérmico demostrando que junto a las interacciones electrostáticas antes descritas, también tienen lugar interacciones de tipo hidrófobo. Se identificaron tres etapas distintas a lo largo del proceso de enlace. En primer lugar, el inicio de la saturación de ADN se caracterizó por la presencia de un comportamiento bifásico en los termogramas; en segundo lugar, el colapso de ADN fue caracterizado por un incremento en el calor absorbido (deltaH endotérmico) con un subsecuente descenso en la entalpía y por último, las interacciones polímero-polímero y complejo-polímero fueron caracterizadas por una transición de tipo exotérmica después de la saturación completa de los grupos fosfato.
6) Finalmente, la eficiencia de la transfección se vio favorecida en los poliplejos formados con pDADMACs de valencias bajas (especialmente para los N/P ¿ 6), sin embargo, la tasa de transfección en general puede ser considerada como baja en comparación con el lipoplejo ADN-MEP. El motivo por el cual la tasa de la transfección es baja (como en el caso del quitosano) se atribuye de nuevo a la alta afinidad entre el ADN y pDADMAC, junto con la conformación núcleo-coraza anteriormente citada.
C) Lipoplejos ADN-MEP vs. poliplejos ADN-quitosano y ADN-pDADMAC En las condiciones de la transfección los lipoplejos presentaron las siguientes características: 1) Un radio hidrodinámico promedio en torno a 135 nm.
2) Una conformación del tipo collar de perla con hebras de ADN saliendo de las superficies de la vesícula y presumiblemente conectando un liposoma con otro.
3) En lo que consideramos uno de los resultados más interesantes, un valor de potencial Z en torno a -45 mV.
En lo que al tamaño del complejo se refiere, en general se cree que la captación celular del complejo se ve facilitada a medida que las dimensiones de este último se hacen más pequeñas.
Teniendo en cuenta que el tamaño del lipoplejo ADN-MEP (135 nm) es equivalente a los reflejados por los sistemas ADN-quitosano (190-250 nm) y ADN-pDADMAC (80-115 nm), se puede afirmar que los bajos valores de transfección de los poliplejos no se deben a un factor de tamaño.
Las principales diferencias entre poliplejos y lipoplejos se ven reflejadas en la morfología y en el potencial Z. Analizando en primer lugar la morfología de la lipoplejos, se observa que el ADN no está completamente recubierto por los liposomas, es decir, algunos segmentos de ADN son accesibles para el entorno del complejo. Este resultado es en cierto modo contradictorio y merece ser estudiado en un mayor detalle. Es evidente que el mecanismo de liberación del endosoma (dentro del núcleo celular) se debe ver facilitado por el hecho de que el ADN se encuentra parcialmente descubierto a priori. Sin embargo, durante el proceso de internalización a la celula, los segmentos expuestos de ADN son propensos a degradación enzimática. En relación a los resultados de potencial Z obtenidos para los lipoplejos (valores negativos), el proceso de internalización de este tipo de complejos no está bien documentado, aunque algunos autores han propuesto una vía fagocitótica.
3.2 Trabajo futuro Como ya se ha demostrado, los vectores catiónicos aquí estudiados (quitosano y pDADMAC) formaron complejos con el ADN con unas prometedoras características para su uso en transfección (es decir, partículas estables y compactas, con valores de potencial Z positivos). Sin embargo, como hemos puesto de manifiesto la eficiencia de transfección fue más bien baja.
A la luz de los resultados obtenidos, una comprensión más profunda tanto del mecanismo de internalización celular de los complejos como del proceso de de-compactación del ADN dentro de la célula debe, en nuestra opinión, lograrse con el fin de mejorar el proceso de transfección. Aunque se han hecho algunos trabajos pioneros en este sentido, surge la necesidad de un enfoque racional para el control del proceso. Un siguiente paso a este trabajo seria el estudio del mecanismo de captación celular de los poliplejos, así como la de-compactación del ADN en el interior celular.
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