Desarrollo de péptidos neuroprotectores frente a la isquemia cerebral basados en el receptor de glutamato de tipo NMDA y su proteína interaccionante PSD-95

• Autores: Sara Ayuso Dolado
• Directores de la Tesis: Margarita Díaz-Guerra González (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2017
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco Wandosell (presid.), Isabel Lastres Becker (secret.), Anna Rosell Novel (voc.), José Antonio Esteban García (voc.)
• Programa de doctorado: Programa Oficial de Doctorado en Bioquímica, Biología Molecular, Biomedicina y Biotecnología (Biociencias Moleculares)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen

  • Resumen La activación fisiológica del receptor de glutamato de tipo N-metil-D-aspartato (NMDAR) promueve la supervivencia neuronal y es crítica en procesos de plasticidad sináptica, memoria y aprendizaje. Por el contrario, su activación patológica conduce a una forma de muerte neuronal denominada excitotoxicidad, responsable principal de la degeneración neuronal secundaria propia de la isquemia cerebral y también asociada con hipoglucemia, enfermedades neurodegenerativas y otras patologías neurológicas. En excitotoxicidad, la pérdida de homeostasis del Ca2+ provoca la activación de la proteasa calpaína que, entre otros sustratos, procesa eficientemente las subunidades GluN2 del NMDAR y su proteína interaccionante PSD-95 (postsynaptic density-95). Este procesamiento genera subunidades GluN2A truncadas, deficientes en la señalización prosupervivencia, y fragmentos estables de PSD-95 que desacoplan la red de interacciones proteicas mediada por esta proteína de andamiaje en la PSD. En este Tesis, hemos caracterizado el procesamiento de PSD-95 en un modelo en rata de daño neuronal inducido por hipoglucemia, donde la excitotoxicidad y la activación de calpaína en corteza parietal y estriado originan fragmentos de PSD-95 en proporción a la severidad del daño.

    El procesamiento de PSD-95 en regiones interdominio discretas es muy similar al identificado en modelos celulares de excitotoxicidad y de isquemia permanente en ratón, donde la fragmentación es un proceso muy temprano. El procesamiento de GluN2A en el tejido infartado es igualmente temprano aunque mucho más complejo, dando lugar a un gran fragmento N-terminal muy estable y múltiples fragmentos intracelulares de baja estabilidad. Para interferir el procesamiento de GluN2A y PSD-95 en excitotoxicidad, hemos desarrollado diferentes péptidos conteniendo pequeñas secuencias de estas proteínas a continuación de una secuencia de la proteína Tat del VIH que confiere permeabilidad a la membrana plasmática y a la barrera hematoencefálica. Entre los péptidos diseñados para PSD-95, TP95414 (aa. 414-427) previene eficientemente su degradación y mejora la supervivencia neuronal en excitotoxicidad in vitro, si bien no hemos podido demostrar todavía un efecto neuroprotector en isquemia. Por otra parte, TG2A1179 (aa. 1179-1192) interfiere el procesamiento de GluN2A inducido in vitro y preserva la activación de los factores de transcripción CREB y MEF2, que mantienen su actividad promotora sobre la transcripción de genes prosupervivencia como el receptor de neurotrofinas TrkB, su ligando BDNF o las propias subunidades GluN2A y GluN1 del NMDAR.

    Los resultados muestran también que la susceptibilidad de GluN2A al procesamiento depende del estado de fosforilación de sus tirosinas y sugieren fuertemente que el efecto neuroprotector establecido para TG2A1179 es debido al mantenimiento específicamente de la fosforilación de los residuos Y1184 y/o Y1187. Estos aminoácidos tendrían, por tanto, un papel regulador clave sobre la estabilidad de GluN2A y su fosforilación disminuiría la susceptibilidad de la subunidad al procesamiento. Finalmente, una forma modificada de este péptido, MTG2A1179, que previsiblemente aumenta su estabilidad en plasma, tiene un efecto neuroprotector in vivo ya que reduce de manera estadísticamente significativa el volumen de tejido cerebral infartado y provoca una recuperación funcional en isquemia cerebral permanente. Estos resultados señalan la importancia de preservar la señalización fisiológica de los NMDARs formados por subunidades GluN2A en situaciones de daño cerebral y el enorme interés de esta proteína como diana terapéutica en neuroprotección.

    Summary Activation of the N-methyl-D-aspartate type of glutamate receptor (NMDAR) in physiological conditions promotes neuronal survival and is critical in processes such as synaptic plasticity, memory and learning.

    However, its pathological activation leads to a form of neuronal death known as excitotoxicity which is largely responsible for secondary neurodegeneration in stroke and is also associated with hypoglycemia, neurodegenerative diseases and other neurological pathologies. The loss of Ca2+ homeostasis during excitotoxicity causes calpain activation which, among other substrates, efficiently cleaves GluN2 subunits of NMDARs and their interacting protein PSD-95 (postsynaptic density-95). Such calpain processing generates truncated GluN2A subunits unable to maintain prosurvival signaling and stable PSD-95 fragments that provoke uncoupling of multiple proteins interacting with this scaffolding protein in the PSD. In this work, we have characterized PSD-95 proteolytic processing in vivo using a rat model of hypoglycemia where excitotoxicity and calpain activation in parietal cortex and striatum generate stable PSD-95 fragments in correlation to the severity of neuronal damage. PSD-95 processing within discrete interdomain regions is very similar to that identified in a cellular model of excitotoxicity or a mice model of permanent ischemia where PSD-95 cleavage is an early process along brain damage. GluN2A processing in the infarcted tissue is similarly an early process but far more complex, resulting in a very large stable N-terminal fragment and multiple intracellular fragments of reduced stability. To interfere GluN2A and PSD-95 processing induced by excitotoxicity, we have developed different peptides that contain short sequences of these proteins located after a HIV Tat sequence which confers the capability to cross the plasma membrane and the blood-brain barrier. Among the peptides designed for PSD-95, TP95414 (aa. 414-427) can efficiently prevent this protein proteolytic degradation, a result correlating with enhancement of neuronal survival under in vitro excitotoxicity. However, we could not demonstrate so far a neuroprotective effect of TP95414 in the ischemia model. On the other hand, peptide TG2A1179 (aa. 1179-1192) interferes in vitro induced GluN2A processing and preserves activation of the transcription factors CREB and MEF2, thus maintaining their promoter activity over the transcription of prosurvival genes, such as the neurotrophin receptor TrkB, its ligand BDNF, or the NMDAR subunits themselves, GluN2A and GluN1. In addition, our results demonstrate that GluN2A susceptibility to calpain processing depends on the phosphorylation status of the subunit tyrosines while strongly suggest that the neuroprotective effect of TG2A1179 could be due to the the maintenance of the specific phosphorylation of GluN2A tyrosine residues Y1184 and/or Y1187. Therefore, these aminoacids could have a key regulatory role on GluN2A stability and their phosphorylation would decrease the subunit susceptibility to calpain processing. Finally, a modified form of this peptide, MTG2A1179, which presumably increases peptide stability in plasma, has also a neuroprotective effect in vivo since it significantly reduces the volume of infarcted brain tissue and causes functional recovery in a model of permanent cerebral ischemia. These results unveil the relevance of preserving physiological signaling of NMDARs containing GluN2A subunits after brain damage and the importance of this protein as a therapeutic target in neuroprotection.