Implicación de los canales de Ca2+ tipo L y RhoA/Rho quinasa en el incremento del tono vascular inducido por la despolarización mantenida: posible papel en la hipertensión arterial
- Autores: Cristina Porras-González
- Directores de la Tesis: Antonio Gonzalo Castellano Orozco (dir. tes.), Juan Ureña López (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2017
- Idioma: español
- Número de páginas: 113
- Tribunal Calificador de la Tesis: Carmen María Vázquez Cueto (presid.), Tarik Smani Hajami (secret.), Ana María Briones Alonso (voc.), Teresa Pérez García (voc.), Jose Manuel Fernandez Fernandez (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: Idus
- Resumen
Nuestro grupo está interesado en estudiar los mecanismos implicados en el mantenimiento del tono vascular en situaciones fisiológicas y fisiopatológicas. Concretamente, nuestro trabajo se centra en el estudio de la implicación de los canales de Ca2+ dependientes de voltaje (LTCCs, "L-Type Ca2+ Channels") presentes en la membrana de los miocitos arteriales, y la ruta de sensibilización a Ca2+ RhoA/Rho quinasa (ROCK), responsable del mantenimiento de la contracción arterial.
La contracción del músculo liso vascular puede está regulada por dos mecanismos: la concentración de Ca2+ citosólico ([Ca2+]i) y los mecanismos de sensibilización a Ca2+. Un aumento [Ca2+]i, por entrada a través de los canales de Ca2+ de la membrana plasmática o por liberación de Ca2+ desde el retículo sarcoplasmico (SR," Sarcoplasmic Reticulum"), provoca la contracción arterial ya que su unión a la calmudulina activa una kinasa que fosforila la cadena ligera de miosina (MLC) permitiendo la interacción de la maquinaria contráctil. Posteriormente una fosfatasa se encarga de provocando la relajación del miocito. Un segundo mecanismo que participa en la contracción del músculo liso son los mecanismos de "sensibilización a Ca2+". Uno de ellos esta mediado por la vía RhoA/ ROCK que actúa provocando la inhibición de la fosfatasa de la MLC manteniendo la contracción. Aunque se conocía la importancia de los LTCCs y la ruta RhoA/ROCK en el control del diámetro arterial durante procesos patológicos que cursan con hiperrreactividad vascular no se había descrito una interacción entre ambas vías. Estudios previos en nuestro laboratorio pusieron de manifiesto que durante un estímulo despolarizante mantenido durante 10-20 min, los LTCCs pueden activar una vía metabotrópica que conduce a la liberación de Ca2+ de los reservorios intracelulares y a la activación de RhoA/ROCK: LTCCs/proteína G/síntesis de InsP3/ liberación de Ca2+ del SR/activación de RhoA/ROCK. Está descrito que los miocitos arteriales durante los procesos patológicos como la hipertensión, presentan una despolarización del potencial de membrana, y que tanto RhoA/ROCK como los LTCCs están participando activamente en el mantenimiento de la contracción. Aunque los antagonistas de los LTCCs (CCBs, "Calcium Channel Bloquers") son frecuentemente usados en el tratamiento de hipercontracción arterial en patologías cardiovasculares y dado que los LTCCs también se expresan en otros tipos celulares como los miocítos cardíacos, los tratamientos actuales presentan efectos adversos. Un primer objetivo de este trabajo consistió en estudiar si la aplicación simultánea de bajas concentraciones de bloqueantes de los LTCCs e inhibidores de ROCK podría tener potencial aplicabilidad clínica para tratar la contracción arterial mantenida minimizando los efectos adversos indeseables de dosis más altas de CCBs. Para el abordaje de este objetivo se midió en un miógrafo la fuerza isométrica generada por anillos arteriales. Con el fin de mimetizar una situación patológica donde las membranas celulares se encuentran despolarizadas, estos anillos se expusieron a una solución externa con una alta concentración de K+. Esta solución genera una contracción con dos componentes, una fase rápida y transitoria (fásica) debida al flujo masivo de Ca2+ al interior celular como consecuencia de la apertura de los LTCCS, y otra más lenta y mantenida (tónica) donde interviene una entrada débil de Ca2+ a través de los LTCCs, la liberación de Ca2+ del SR y la activación de la vía RhoA/ROCK. Nuestros resultados indican que los inhibidores de LTCCs y ROCK a bajas concentraciones pueden inhibir el componente tónico que se genera durante despolarizaciones moderadas de la membrana plasmática, dejando prácticamente inalterado el componente fásico. La aplicación simultánea de ambos inhibidores a dosis inferiores a las necesarias para reducir el componente fásico, presentaron un poderoso efecto inhibitorio sobre el tono arterial mantenido. Para determinar si este tratamiento podría tener efectos secundarios se hicieron experimentos electrofisiológicos y funcionales en corazón completo. El tratamiento combinado con bajas concentraciones de ambos inhibidores no afectó a las propiedades eléctricas medidas en los miocitos vasculares y cardíacos mediante la técnica de patch-clamp. Análogamente, este tratamiento no afectó a la contractilidad cardíaca medida en corazones de ratas aislados perfundidos mediante el sistema Langerdoff. Por ello la combinación de concentraciones bajas de ambos antagonistas podría ser una estrategia terapéutica potencial contra espasmos arteriales patológicos debidos a despolarizaciones duraderas, disminuyendo los efectos secundarios sobre los cambios del potencial de membrana de corta duración que se producen de manera fisiológica en los miocitos vasculares y cardíacos.
Con objeto de simular situaciones fisiopatológicas en las que el músculo liso arterial está permanentemente despolarizado el segundo objetivo de este trabajo se centró en estudiar la sensibilidad a Ca2+ del mecanismo descrito anteriormente (LTCCs y RhoA/ROCK) durante despolarización de larga duración. Para ello se midió la contracción en anillos arteriales despolarizados durante 90 min y se restringió la entrada de Ca2+ al interior celular disminuyendo drásticamente la concentración de Ca2+ extracelular ([Ca2+]e) o bloqueando parcialmente los LTCCs con muy baja concentración de nifedipina. Los resultado obtenidos indican que la despolarización mantenida de arterias bañadas con 7 μM de [Ca2+]e o con 3 nM de nifedipina es capaz de generar la contracción arterial. En arterias permeabilizadas con β-escina se registró contracción inducida por pequeños aumentos de la [Ca2+] (desde una 70 nM), la contracción generada fue sensible a fasudil. Estos resultados sugieren que una débil entrada de Ca2+ a través de los LTCCs es suficiente para activar RhoA/ROCK y generar la contracción arterial. En situaciones fisiopatológicas donde las arterias permanecen despolarizadas durante largos períodos de tiempo, el aumento del tono arterial podría atribuirse a un pequeño flujo de Ca2+ a través de los LTCCs que no se han inactivado completamente, suficiente para activar la ruta RhoA/ROCK.
El tercer objetivo de este trabajo consistió en estudiar si la vasorreactividad mediada por el acoplamiento LTCCs-SR y la vía RhoA/ROCK pueden estar implicados en patologías vasculares como la hipertensión, en las que el músculo liso arterial está permanentemente despolarizado. Las arterias procedentes de animales hipertensos (ratas SHR, "Spontaneously Hypertensive Rats") desarrollan una mayor respuesta contráctil y mayor sensibilidad al estímulo despolarizante o a agonistas de los LTCCs. Maniobras experimentales que alteran el contenido de Ca2+ en el SR indican que los miocitos arteriales de ratas SHR tienen más capacidad de recaptación del ión. La aplicación de cafeína y ácido ciclopiazónico (CPA, "Cyclopiazonic Acid"), activador del receptor de rianodina del SR e inhibidor de la ATPasa del SR, respectivamente, induce una contracción transitoria marcadamente potenciada en las arterias de animales hipertensos. Para evaluar el papel del acoplamiento LTCCs-SR, la solución despolarizante o los agonistas se aplicaron en ausencia de Ca2+ externo. En este caso, se generó una respuesta transitoria que fue mayor en arterias de ratas hipertensas y que fue bloqueada con antagonistas de los LTCCs. La implicación de este acoplamiento LTCCs-SR durante la contracción inducida por la despolarización en presencia de Ca2+ externo se puso de manifiesto cuando se eliminó el Ca2+ del SR en anillos de ratas hipertensas preincubando durante 40 min las arterias en ausencia de Ca2+ externo y bloqueando la ATPasa del SR con CPA. En estas condiciones se redujo selectivamente la fase mantenida de la contracción hasta niveles similares a los registrados en arterias normotensas. El análisis de RhoA en miocitos arteriales reveló un aumento de los niveles y actividad de esta proteína en animales hipertensos. Estos resultados indican que la ruta LTCCs, SR y RhoA/ROCK podría participar en el incremento de vasoreactividad que presentan las arterias de animales hipertensos. Dado que previamente, hemos indicado que la aplicación aislada o conjunta de bajas concentraciones de bloqueantes de los LTCCs y / o inhibidores de ROCK reducen selectivamente el componente tónico de la contracción en la arterias despolarizadas, sin afectar la actividad eléctrica de los miocitos vasculares o la contractilidad de los miocitos cardíacos, la aplicación individual o conjunta de inhibidores de esta ruta podría optimizar el tratamiento de esta patología con menores efectos secundarios.
