Inducción de apoptosis por el agente antileucémico trióxido de arsénico (Trisenox) y otros agentes mitocondriotóxicos: potenciación por inhibidores metabólicos
- Autores: María Cristina Estañ Omaña
- Directores de la Tesis: Patricio Aller Tresguerres (dir. tes.), María del Carmen Boyano Adánez (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Alcalá ( España ) en 2015
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: María Dolores Delgado Villar (presid.), Pilar Sancho López (secret.), Eduardo Rial Zueco (voc.), Dora B. Krimer (voc.), Laura García Bermejo (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
- español
Las células tumorales se caracterizan por tener un metabolismo glucolítico (“Efecto Wärburg”) y lipídico exacerbado para poder mantener un alto índice proliferativo. Esta propiedad abre nuevas oportunidades de intervención farmacológica y como tal, se ha descrito la eficacia antitumoral de algunos inhibidores del metabolismo glucolítico y lipídico. Estos inhibidores han demostrado tener una actividad variable, siendo especialmente eficaces en combinación con agentes antitumorales convencionales.
El trióxido de arsénico (ATO, Trisenox®) es un agente antileucémico de uso clínico frente a la leucemia promielocítica aguda (APL), en monoterapia o en combinación con otros agentes como el ácido retinoico (ATRA) o las antraciclinas. A bajas concentraciones (inferiores a 1 μM) el ATO provoca la degradación de la oncoproteína de fusión PML-RARα (leucemia promielocítica-receptor del ácido retinoico α), característica de las células APL y responsable del bloqueo de su diferenciación. Además, a altas concentraciones este agente provoca muerte por apoptosis en APL y otros tipos de células tumorales, lo que abre nuevas posibilidades de aplicación terapéutica. Sin embargo la utilización del ATO con esta perspectiva requeriría el diseño de estrategias de quimiosensibilización, que permitan incrementar la eficacia y mantener las dosis de ATO dentro de límites tolerables para el organismo. Con estos precedentes, se consideró de interés analizar la posible cooperación para producir apoptosis entre el ATO e inhibidores glucolíticos (lonidamina, 2-desoxiglucosa (2-DG) y 3- bromopiruvato (3-BrP)), e inhibidores de la β-oxidación de ácidos grasos (etomoxir), de conocido interés terapéutico, y en caso positivo analizar los factores determinantes de dicha cooperación. Como modelo celular principal se usaron células leucémicas mieloides agudas (AML) humanas HL60, dada su escasa sensibilidad basal al ATO, empleando ocasionalmente linfocitos humanos (PBLs) mitogénicamente estimulados como modelo no tumoral. Los resultados obtenidos pueden resumirse del siguiente modo:
1.- Usados a concentraciones subletales, la lonidamina, la 2-DG y el etomoxir cooperan eficazmente con ATO para producir apoptosis en las células HL60 y otros modelos de células leucémicas, siendo escasa o nula la cooperación en PBLs. Así mismo, la cooperación de dichos inhibidores metabólicos con otros agentes antitumorales (cisplatino, etopósido) es nula o muy escasa. A diferencia de los otros inhibidores metabólicos, el 3-BrP es por sí solo fuertemente citotóxico (apoptosis y necrosis) y la eficacia de la cooperación con ATO es menor.
2.- Los inhibidores glucolíticos, al igual que el ATO, son agentes mitocondriotóxicos (con diana directa en la mitocondria). Como tal, la lonidamina y la 2-DG indujeron permeabilidad de membrana mitocondrial interna (mIMP) y disipación de potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm). Estos efectos pueden ser una precondición para la apoptosis, pero no explican por sí solos la potenciación de muerte en los tratamientos combinados. Además de ello, estos agentes provocaron la permeabilización de la membrana mitocondrial externa (mOMP) y activación de la vía ejecutoria intrínseca de la apoptosis, lo que incluyó la liberación del citocromo c y otros factores mitocondriales al citosol, la activación por translocación de Bax a la mitocondria y la degradación de XIAP, efectos que se ven claramente potenciados en los tratamientos combinados.
3.- En lo concerniente a parámetros energéticos se han obtenido respuestas muy variables. (a) Así, la 2-DG y el 3-BrP provocaron una reducción variable de los valores netos de ATP, mientras que la lonidamina y el etomoxir no, y en todos los casos los efectos no se alteraron en el cotratamiento con el ATO. La disminución observada de los niveles de ATP parece ser irrelevantes para la muerte celular, a excepción de la casi total abolición de ATP provocada por altas concentraciones (necrotizantes) de 3-BrP. (b) La 2-DG produjo la inhibición dosisdependiente de la glucólisis sin afectar la respiración mitocondrial; el etomoxir inhibió la respiración mitocondrial, efecto que se vio compensado en parte por la activación de la glucólisis; el 3-BrP produjo una inhibición de ambos parámetros, glucólisis y respiración mitocondrial. (c) El análisis de los porcentajes relativos de nucleótidos de adenina tras los tratamientos con 2-DG, 3-BrP y etomoxir, solos y en combinación con ATO, indican incrementos variables en el cociente AMP/ATP y bajada de la carga energética, cuyo significado funcional está por determinar.
4.- Una consecuencia temprana a la inhibición del metabolismo y en concreto de la respiración mitocondrial puede ser la generación y acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS), que podría tener efectos celulares deletéreos. En efecto, la lonidamina, el 3-BrP y el etomoxir indujeron un incremento moderado del contenido intracelular de ROS que, si bien no explica la toxicidad ocasional de los agentes por sí solos, sí explica el incremento de letalidad observado en la combinación con ATO, ya que este agente es muy sensible al estrés oxidativo. Por el contrario, la 2-DG no incrementó, e incluso provocó disminución de ROS. Además el etomoxir (levemente) y el 3-BrP (de modo dosis-dependiente) provocaron reducción del contenido de GSH intracelular, lo cual puede también explicar el incremento de letalidad del ATO en los tratamientos combinados y, en el caso del 3-BrP, la toxicidad por sí sólo a altas concentraciones.
5.- El análisis de diferentes vías de señalización por proteínas quinasas deparó múltiples resultados, entre los que se destacan los siguientes: (a) La lonidamina, la 2-DG y el 3-BrP activaron las vías de señalización PI3K/Akt/mTOR y MEK/ERK, que tienen siempre un carácter defensivo (antiapoptótico), y puede explicar la escasa eficacia de la mayoría de esos agentes en monoterapia. (b) Al menos en el caso de la 2-DG, dicha activación está a su vez mediada por la estimulación temprana del IGF-1R. (c) La activación de dichas vías y de IGF1R se previno por el cotratamiento con ATO, lo que explica en parte la mayor eficacia de los tratamientos combinados. (d) Mientras que la lonidamina y el etomoxir provocaron la activación de la vía sensible a estrés metabólico LKB-1/AMPK, sorprendentemente la 2-DG y el 3-BrP produjeron su inactivación. (e) Ésta inactivación de LKB-1/AMPK por 2-DG y 3- BrP ocurre como respuesta a la activación de Akt, dado el probado carácter antagónico de dichas quinasas. (f) La potenciación de la apoptosis en los tratamientos combinados con ATO estaba favorecida por la inactivación de AMPK en el caso de la 2-DG y del 3-BrP, y favorecida por la activación de la quinasa en el caso de la lonidamina y del etomoxir.
6.- Fue posible mejorar la eficacia apoptótica mediante la doble intervención de ambas vías energéticas, glucólisis y β-oxidación de los ácidos grasos, como se probó por tratamiento combinado de 2-DG o lonidamina con etomoxir, y lo que es más, el efecto del tratamiento combinado se incrementó por la coincubación con ATO. No obstante el uso potencial de este tipo de tratamiento combinado está sujeto a varias restricciones, tales como la dependencia de su eficacia respecto a las características metabólicas intrínsecas del modelo celular leucémico usado, y cierta cooperación también observada en células no tumorales (PBLs). Así mismo, los estudios sobre mecanismos potencialmente explicativos de la cooperación entre distintos tipos de inhibidores metabólicos no han dado por ahora resultados concluyentes.
En resumen, aunque los resultados que aquí se presentan han sido obtenidos utilizando sólo modelos celulares in vitro, permiten sugerir que las combinaciones adecuadas entre algunos inhibidores metabólicos y agentes antitumorales como el ATO podrían servir para incrementar la eficiencia clínica de estos agentes, la cual es normalmente escasa en monoterapia.
- English
One of the common characteristics of tumor cells is their altered metabolic rate. Cancer cells mainly rely in high glycolysis rates to produce lactate (“Warburg effect”) and increased lipid metabolism to sustain the high energy demand of proliferating cells. This fact provides us with new opportunities for pharmacologic intervention. Thus, variable antitumor efficacy has been described for several glycolytic and lipid metabolism inhibitors. These are mostly used in combination with conventional antitumor drugs, but they have variable efficiencies.
Arsenic trioxide (ATO, Trisenox) is an antileukemic agent against acute promyelocytic leukemia (APL), used in the clinics as a single agent or in combination with other drugs (retinoic acid (ATRA) or anthracyclines). At low concentrations, (<1 μM) ATO induces the degradation of oncoprotein PML-RARα (promyelocytic leukemia- all trans retinoic acid receptor alfa), which is found in APL and responsible of differentiation blockade. At high concentrations, ATO induces apoptotic cell death in APL and other tumor cells, which offers us new possibilities of therapeutic intervention. However, these applications would require the design of chemo-sensitization strategies in order to increase the efficiency and maintain clinically well-tolerated doses. Based on this, we aimed to analyze the potential cooperation between ATO and three glycolysis inhibitors (lonidamine, 2-deoxyglucose and 3- bromopyruvate) or a fatty acid β-oxidation inhibitor (etomoxir) in the induction of apoptosis in AML cells and to study the possible mechanisms involved. The main cell model utilized was the HL60 cell line, that is derived from an AML patient, due to its low sensitivity to ATO, and occasionally mitogen-stimulated peripheral blood lymphocytes (PBL) were used as a nontumoral cell model. Results obtained can be summarized as follows:
1. Used at clinically well tolerated doses, lonidamine, 2-DG and etomoxir efficiently cooperated with ATO to induce apoptosis in HL60 cells and other leukemic cell models, with limited efficacy in PBLs. Moreover, cooperation of such inhibitors with other antitumor drugs (cisplatin, etoposide) was limited or null. In contrast, 3-BrP was highly citotoxic (apoptosis and necrosis), by itself and the cooperation with ATO was lower.
2. Glycolytic inhibitors as well as ATO are mitochondrion-targeted drugs. Thus, lonidamine and 2-DG induced mitochondrial inner membrane permeability (mIMP) and membrane potential dissipation (ΔΨm). These effects can be a pre-condition of apoptosis, but do not explain by themselves the potentiation of apoptosis in combined treatments. Moreover, these inhibitors triggered mitochondrial outer membrane permeability (mOMP) and subsequent activation of the intrinsic apoptotic pathway that includes exportation of cytochrome c and other mitochondrial factors to cytosol, activation/translocation of Bax to mitochondria and XIAP degradation, phenomenon that are clearly potentiated in combined treatments.
3. According to energetic parameters, variable responses have been obtained. Thus, (a) 2-DG and 3-BrP triggered variable ATP depletion, whereas lonidamine and etomoxir did not, and in all cases these effects were not altered by co-treatment with ATO. The observed ATP depletion may be irrelevant in terms of cell death induction, except for the total ablation observed at necrotizing 3-BrP concentrations. (b) 2-DG induced dose-dependently glycolysis inhibition without affecting mitochondrial respiration; etomoxir inhibited mitochondrial respiration, effect which was compensated by glycolysis activation; and 3-BrP inhibited both, glycolysis and mitochondrial respiration. (c) The determination of adenine nucleotide subpopulations after treatment with 2-DG, 3-BrP and etomoxir, alone or in combination with ATO, showed variable increases in the AMP/ATP ratio and a decrease of energy charge, whose functional significance is yet to be determined.
4. An early consequence of metabolic inhibition, mainly of mitochondrial respiration, is reactive oxygen species (ROS) generation and accumulation, which could have deleterious effects. For instance, lonidamine, 3-BrP and etomoxir induce a moderate increase in the intracellular ROS content. Although this increase is not sufficient to justify single-drug toxicity, it explains the increase in lethality observed in combinations with ATO, which is an oxidative stress-sensitive agent. In contrast, 2-DG does not increase, but instead decreases ROS content. Moreover, etomoxir (slightly) and 3-BrP (dose-dependently) trigger intracellular GSH depletion, which may also explain their increased lethality in combination with ATO and, in the case of 3-BrP, its toxicity at higher concentrations.
5. Analysis of multiple protein kinase signaling pathways yielded multiple results, including: (a) lonidamine, 2-DG and 3-BrP activated the defensive (antiapoptotic) signaling pathways PI3K/Akt/mTOR and MEK/ERK, which explains the limited efficacy of these agents in monotherapy. (b) In the case of 2-DG, such activation is mediated by the early activation of insulin growth factor receptor-1 (IGF-1R). (c) The activation of these pathways is prevented by cotreatment with ATO, which in part explains the higher efficacy of combined treatments. (d) While lonidamine and etomoxir induce LKB-1/AMPK activation, 2-DG and 3-BrP unexpectedly induced inactivation. (e) 2-DG and 3-BrP-mediated inactivation of LKB- 1/AMPK occurs as a consequence of Akt activation, since both LKB-1/AMPK and PI3K/Akt behave as antagonic pathways. (f) Apoptosis enhancement in combined treatments is favored by AMPK inactivation in the cases of 2-DG and 3-BrP, and favored by AMPK activation in the case of lonidamine and etomoxir.
6. It is possible to improve apoptotic efficacy by the double inhibition of both energetic pathways, glycolysis and fatty acid oxidation, as it was demonstrated in the combined treatment of etomoxir with 2-DG or lonidamine and, furthermore, the effect of combined treatments is enhanced by co-incubation with ATO. Nevertheless, the potential use of this combined treatment is subject to restrictions, such the intrinsic metabolic properties of the tumor cell type used, as well as the fact that certain cooperation was observed in non-tumor cells (PBLs). Moreover, the study of the potential mechanisms involved in such cooperation has not had concluding results (yet).
In summary, although the results shown herein have been obtained from in vitro cell models, they allow us to suggest that adequate combinations of metabolic inhibitors and antitumor agents like ATO could be useful to increase the clinical efficacy of all these agents, which is normally limited in monotherapy.
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