Resumen de Efectos de films de fibroína de seda/óxido de grafeno vs fibroína de seda/óxido de grafeno reducido sobre células madre humanas de ligamento periodontal
OBJETIVOS El objetivo general de esta tesis es búsqueda de un biomaterial híbrido basado en grafeno y fibroína en una adecuada proporción de ambos, sobre el que las hPDLSCs muestren buenos resultados de adhesión, viabilidad, proliferación y/o diferenciación hacia diversos tipos celulares. Para alcanzarlo, se establecieron los siguientes objetivos específicos: • Objetivo 1: Elaboración y caracterización de films compuestos por grafeno y fibroína con distintas configuraciones y composiciones, con el fin de optimizar sus propiedades y potenciales aplicaciones en ingeniería de tejidos. • Objetivo 2: Evaluación in vitro de la morfología, proliferación, viabilidad y perfil mesenquimal de las hPDLSCs sobre los films elaborados, como puntos fundamentales en la optimización de este biomaterial híbrido. • Objetivo 3: Estudio de la capacidad inductora de diferenciación hacia osteoblastos, condroblastos o cementoblastos de los distintos materiales analizados en cultivos de hPDLSCs. METODOLOGÍA Las células madre de ligamento periodontal (hPDLSCs) se obtuvieron mediante la realización de cultivos primarios a partir de ligamento periodontal humano. Se realizaron distintas combinaciones de fibroína de seda y óxido de grafeno en forma de films, preparando una versión reducida de las misma configuraciones con ácido ascórbico. El análisis de la topografía de los materiales y la morfología celular se realizó mediante microscopía electrónica de barrido. La proliferación celular se estudió empleando el ensayo MTT. Mediante citometría de flujo se analizaron marcadores de superficie de células madre mesenquimales y viabilidad celular. Para el ensayo de expresión génica se realizó qPCR de genes codificantes para factores de transcripción específicos de osteo/condroblastos (RUNX2, SOX9 y SP7/OSX), proteínas osteoblásticas (BMP2, ALP, COL1A1 y BGLAP) y genes relacinados con cemento (PTPLA/CAP y CEMP1). CONCLUSIONES 1. La forma en que se disponen y mezclan SF y GO en la elaboración de los biomateriales como scaffolds 2D condiciona la topografía de los films. Esto ha dado como resultado la obtención de superficies con distinto grado de rugosidad, habiéndose observado desde superficies prácticamente lisas hasta superficies con características similares a un scaffold 3D. 2. En la mayoría de los films se observa la morfología fusiforme típica que muestran las hPDLSCs en cultivo de mantenimiento. Esta morfología se ve afectada al crecer en contacto directo con una superficie de fibroína pura, perdiendo la silueta fusiforme que sí se observa en el resto de configuraciones. 3. Tras 10 días en cultivo, la mayor tasa de proliferación de las hPDLSCs se alcanza, indistintamente, sobre los films de GO puro y la mezcla rGO:rSF(1:3). Sin embargo, sobre los films híbridos se observa la tendencia de una mayor proliferación en las formas reducidas que en las oxidadas. 4. Todos los films elaborados han resultados altamente biocompatibles en cultivos con hPDLSCs, obteniendo en todos los casos una viabilidad superior al 95% después de 10 días en cultivo. 5. Las hPDLSCs cultivadas durante 10 días muestran mayoritariamente una desregulación significativa de la expresión de marcadores mesenquimales (CD73, CD90 y CD105), principalmente cuando los materiales contenían rGO en su composición, lo que sugiere que se encuentren en un proceso de diferenciación. 6. El perfil de expresión génica de las hPDLSCs y la observación de depósitos de calcio tras su cultivo durante 10 días en el medio de inducción osteogénico Osteodiff®, indican que las hPDLSCs tienen plasticidad fenotípica y capacidad para diferenciarse a cementoblastos o a osteoblastos funcionales. 7. Se han hallado dos films sobre los que se obtiene una proliferación moderada, la configuración pura de rGO y la bicapa rGO/rSF, capaces de inducir, tras 10 días en cultivo, la diferenciación de hPDLSCs hacia células cementoblásticas sin la necesidad de añadir ninguna molécula inductora de este tipo de diferenciación. 8. De entre las configuraciones estudiadas, la bicapa rGO/rSF sería el film de elección (para continuar la línea de investigación de aplicaciones eventuales en terapia celular periodontal) al hallar un equilibrio entre consistencia del biomaterial, morfología, proliferación, viabilidad, perfil mesenquimal y capacidad diferenciadora de las hPDLSCs. OBJECTIVES The aim of the present thesis is searching and hybrid biomaterial based on graphene and fibroin in an appropiate amount, where hPDLSCs show suitable results of adhesión, viability, proliferation and/or differentiation. • Objective 1: Manufacturing and characterization of films made of graphene and fibroin with different configurations to optimize their properties and potencial applications in tissue engineering. • Objective 2: In vitro evaluation of morphology, proliferation, viability and mesenchimal profile of hPDLSCs on every manufactured film. • Objective 3: To study the differentiting capacity to osteoblast, chondroblast or cementobblast-like cells of the different films in culture cell of hPDLSCs. METHODS Human periodontal ligament stem cells were obtained from human periodontal ligament primary cultures. Different configurations of silk fibroin and graphene oxide were manufactured as films, also in a reduced form with ascorbic acid treatment. Films topography and cell morphology were analyzed by scannig electronic micrsocopy. MTT assay was employed proliferation study. Flow citometry was used to analize expression of mesenchymal stem cell surface markers and celular viability. qPCR were run for gene expression analysis; different clusters of genes coding for osteo/chondroblast specific transcription factors (RUNX2, SOX9 and SP7/OSX), osteoblast-related proteins (BMP2, ALP, COL1A1 and BGLAP) as well as cementum-related genes (PTPLA/CAP and CEMP1) were assayed. CONCLUSIONS Graphene-fibroin-based biomaterials provide a new type of biocompatible scaffolds for stem cells. In graphene-fibroin composites, graphene supplies differentiating capacity, whereas SF cause no inflammatory response after their implantation, also providing to GO a better handling and 3D characteristics. Generally, reduced configurations gave better results in proliferation and gene expression, being these configurations the optimal in order to perform future in vivo experiments. In addition, the extracellular matrix resulting from our osteo/cementoblast-like cells may be more physiologically synthesized and mineralized than those from hydroxyapatite-derived substrates. hPDLSCs proliferation rate was consistently improved in certain combinations containing low amounts of graphene and a high fibroin dose. Remarkably, bilayer composites with graphene on the contact surface with cells promoted a moderate proliferation, and favoured a cementoblast differentiation of hPDLSCs in the absence of any growth factors.
