Resumen de Avances en conservación de semen y separación de espermatozoides X e Y en la especie canina
Over the last years, reproductive technologies as arti?cial insemination (AI) and semen conservation procedures are increasingly demanded in canine species and the optimization of these procedures are the main goal of numerous investigations. On the other hand, the study and development of new technologies applicable to the canine species in the area of reproductive biotechnology is also increasing. In this context, we have considered that the possible application of sex-sorting technology by flow cytometry in combination with other routine reproductive techniques mentioned above, could contribute relevantly to optimize the efficiency of canine breeding. The main objective of this Thesis was to optimize the protocols for chilling and cryopreservation of dog spermatozoa and to design an effective protocol for canine spermatozoa sex-sorting using flow cytometry. To achieve this objective, the following studies were developed. In the first study, the effects of various rapid cooling rates from room temperature (23 ºC) to 5ºC on sperm quality of chilled and cold-stored (96 h) canine spermatozoa, using a Tris fructose extender with 20% egg yolk was evaluated. For this purpose, sperm rich fraction samples were pooled (experiment 1) or processed individually (experiment 2) and split into different aliquots that were chilled to 5 °C using different cooling rates of 2.25, 0.9, 0.45, and 0.2 (control) °C/min. In the second study, the effects of rapid cooling prior to freezing on frozen-thawed canine sperm quality. For this purpose 2 experiment were carried out. In experiment 1, centrifuged ejaculates from 6 dogs were pooled, split into 4 aliquots and cryopreserved by the Uppsala procedure using different cooling rates (control, 0.2 C/min; rapid, 2.25 C/min) in combination with 2 glycerol addition protocols (fractionated or unfractionated). In experiment 2, centrifuged ejaculates from 4 dogs were processed individually using the same cooling rates described in experiment 1 in combination with an unfractionated glycerol addition protocol. In the third study, 3 the objective was to optimize Hoechst 33342 staining concentrations for the flow cytometric identification and separation of X- and Y-chromosome-bearing canine spermatozoa. Additionally, to determine whether variations between dogs exist that affect the sex-sorting of spermatozoa. Semen samples from six dogs were diluted to 100 × 106 sperm/mL, split into four aliquots, stained with increasing H-42 concentrations (5, 7.5, 10 and 12.5 ?L, respectively) and sorted by flow cytometry. The rates of non-viable, percentages of oriented and selected spermatozoa, as well as the average sorting rates (sorted spermatozoa/s), were used to determine the sorting efficiency. The results achieved in these four studies have generated the following conclusions: the use of a rapid cooling rate of 2.25 ºC/min can be an efficient alternative to the use of a slow cooling rate in protocols for chilling canine semen using a TCF 20% egg yolk extender, maintaining optimal values of sperm quality during a long period of cold-storage (96 h). Dog spermatozoa can be cryopreserved using a rapid cooling rate of 2.25ºC/min prior to freezing with the Uppsala method, in combination with a fractionated or unfractionated glycerol addition procedure. Sperm sex-sorting by flow cytometry can be performed successfully in canine samples using between 7.5 and 12.5 ?L of H-42. In addition, significant individual differences are evident in the sorting efficiency of canine spermatozoa.Actualmente, biotecnologías reproductivas como la inseminación artificial (IA) y procedimientos para la conservación de espermatozoides como la refrigeración y criopreservación son técnicas muy demandadas en la especie canina. Así mismo, la optimización de estos protocolos ha sido y sigue siendo objetivo de la mayoría de investigaciones en el campo de la reproducción canina. Desde un punto de vista práctico, resultaría muy interesante la disminución del tiempo empleado en enfriar las muestras de semen hasta 5 ºC durante los procesos de conservación. Por otra parte, destacar la importancia que supondría en esta especie el desarrollo de nuevas biotecnologías reproductivas. En especial, sería muy interesante poder combinar técnicas utilizadas de forma rutinaria, como la IA y los protocolos de conservación seminal, con otras técnicas reproductivas como la preselección del sexo de la descendencia mediante separación de espermatozoides X e Y por citometría de flujo. Por todo lo mencionado anteriormente, la finalidad principal de esta Tesis fue optimizar los procedimientos de conservación de semen, así como diseñar un protocolo para la separación de espermatozoides X e Y mediante citometría de flujo en la especie canina. Para lograr este objetivo, los siguientes estudios fueron realizados. En el primer estudio, se evaluó el efecto de diferentes ratios de enfriamiento rápido, desde temperatura ambiente (23 ºC) hasta 5 ºC, sobre la calidad del semen canino refrigerado y conservado durante 96 horas, utilizando un medio de Tris fructosa con un 20% de yema de huevo. Para ello, las fracciones espermáticas procedente de 5 perros fueron agrupadas en un pool (experimento 1) o procesadas individualmente (experimento 2) y divididas en diferentes alícuotas las cuales fueron refrigeradas a 5 ºC utilizando diferentes ratios de enfriamiento de 2,25, 0,9, 0,45 y 0,2 (control) º C/min. En el segundo estudio, se evaluó el efecto de una ratio de enfriamiento rápido antes de la congelación sobre la calidad del semen canino criopreservado utilizando el método Uppsala, en combinación con la adición fraccionada o no de glicerol. Para ello, se llevaron a cabo 2 experimentos. En el experimento 1, las fracciones espermáticas de 6 perros fueron agrupadas en un pool, divididas en cuatro alícuotas y criopreservadas mediante el método Uppsala usando diferentes ratios de enfriamiento (control, 0,2 ºC/min y rápido, 2,25 ºC/min) en combinación con 2 protocolos de adicción del glicerol (fraccionado y no fraccionado). En el experimento 2, las fracciones espermáticas de 4 perros fueron procesadas usando los mismos ratios de enfriamiento que en el experimento 1 en combinación con una adicción no fraccionada de glicerol. En el tercer estudio, el objetivo fue optimizar las concentraciones de Hoechst 33342 (H-42) para la identificación y separación de los espermatozoides X e Y mediante citometría de flujo y determinar si existen variaciones entre individuos que afecten al proceso de separación espermática en la especie canina. Las fracciones espermáticas de seis perros fueron divididas en cuatro alícuotas y teñidas con concentraciones crecientes de H-42 (5, 7,5, 10 y 12,5 µL, respectivamente). La identificación y separación de espermatozoides X e Y fue realizada mediante citometría de flujo. Se analizaron los porcentajes de espermatozoides no viables, espermatozoides correctamente orientados, espermatozoides seleccionados o separados, así como finalmente la velocidad de separación (espermatozoides separados/s). Tras los resultados de estos estudios, podemos concluir que: Una ratio de enfriamiento rápido de 2,25 ºC/min puede ser utilizada de forma eficiente en protocolos para la refrigeración de semen canino, utilizando un medio tris fructosa con un 20% de yema de huevo, consiguiendo valores óptimos de calidad espermática durante largos periodos de conservación a 5 º C (96 h). Los espermatozoides caninos pueden ser criopreservados mediante el método Uppsala con una adición fraccionada o no de glicerol, utilizando una ratio de enfriamiento rápido de 2,25 ºC/min antes de la congelación. La separación de espermatozoides X e Y mediante citometría de flujo puede realizarse con éxito en la especie canina utilizando entre 7,5 y 12,5 ?L de Hoechst 33342. Además, diferencias entre individuos pueden afectar significativamente a la eficiencia del proceso de separación.
