Resumen de Hydrogels based on short amphipathic peptides: self-assembly studies and applications
Annex I: Summary in Spanish I. Tema y objetivos de la tesis Debido a la estrecha relación entre el auto-ensamblaje de péptidos y proteínas con las enfermedades de tipo amiloide,(1) entender los principios que gobiernan este fenómeno resulta de gran interés en la actualidad. El uso de pequeños péptidos como modelos o inhibidores del proceso de fibrilación es considerado una de las mejores aproximaciones debido a su facilidad de síntesis, versatilidad y biocompatibilidad.(2) Se conoce además que la organización jerárquica de estas fibrillas peptídicas da lugar a menudo a redes auto-ensambladas que retienen el disolvente dando lugar a geles supramoleculares.(3) Estos materiales soportados mediante interacciones no covalentes presentan multitud de propiedades incluyendo reversibilidad, auto-reparación o sensibilidad frente a diferentes estímulos físico-químicos que hacen de ellos unos materiales extremadamente útiles en campos tan diferentes como la biomedicina, la catálisis o la ciencia de materiales.(4) Teniendo en cuenta estas consideraciones durante el transcurso de la presente tesis doctoral se han desarrollado nuevos péptidos anfipáticos con tendencia a la formación de hojas-ß para: - Profundizar en los fundamentos del auto-ensamblaje proporcionando un mayor entendimiento del complejo proceso de fibrilación.
- Estudiar la habilidad de estos compuestos como hidrogelantes supramoleculares para utilizarlos como catalizadores o materiales que respondan a estímulos.
II. Resultados y discusión 1) Diseño y síntesis de los hidrogelantes supramoleculares El primer paso para alcanzar los objetivos previamente mencionados consiste en el diseño y la síntesis de los compuestos que posteriormente van a ser estudiados como hidrogelantes. En nuestro caso se han sintetizado tres familias de compuestos anfipáticos derivados de péptidos cuya estructura general se describe a continuación:
- Tetrapéptidos básicos formados por L-fenilalanina (F) y L-aspártico (D) Compuestos por dos fenilalaninas y dos residues de ácido aspártico protegidos por un grupo Cbz y una cadena alifática en el extremo C- y -N terminal respectivemente. La tendencia de dichos péptidos anfipáticos a la formación de hojas ß ha sido previamente demostrada en multitud de ocasiones y en nuestro caso, las variaciones sistemáticas en la secuencia de aminoácidos nos permitirán estudiar el papel que desempeña el balance hidrofóbico/hidrofílico en el proceso de fibrilación. Es necesario mencionar que ambos extremos de la cadena peptídica han sido bloqueados usando una pequeña cadena alifática y un grupo protector de tipo benciloxicarbonilo en el extremo C- y N-terminal respectivamente para evitar ionizaciones adicionales y simplificar de ese modo el análisis del proceso de agregación.
- Tetrapéptidos básicos formados por L-fenilalanina (F) y L-lisina (K) De modo semejante a los tetrapéptidos descritos en el párrafo anterior se han diseñado adicionalmente dos tetrapéptidos básicos que contienen lisina para estudiar su habilidad como hidrogelantes y posteriormente estudiar su coagregación con sus análogos tetrapeptídicos que contienen aspártico.
- Tripéptidos anfifílicos formados por L-prolina (P), L-fenilalanina (F) y L-ácido glutámico (E) Finalmente una familia de tripéptidos anfifílicos que contienen L-prolina como fragmento funcional ha sido diseñada para su posterior estudio de agregación en agua tamponada y como catalizadores de condensaciones aldólicas.
La síntesis de todos ellos ha sido llevada a cabo mediante una metología por pasos en disolución y los compuestos fueron obtenidos sin dificultad y con buenos rendimientos. Además la purificación se realizó de manera sencilla sin necesidad de cromatografía. Sin embargo, debido a la creciente utilización de fase sólida para la síntesis de derivados peptídicos se ha decidido probar también dicha metodología en la síntesis de uno de nuestros compuestos estableciendo finalmente ventajas e inconvenientes de cada metodología para nuestros propósitos en particular. Así pues se ha establecido que la síntesis en fase sólida podría ser de gran utilidad para fabricar pequeñas cantidades de compuesto destinadas a una evaluación inicial de sus propiedades. La síntesis en disolución sin embargo, podría ser utilizada para la obtención a mayor escala de aquellos que resulten más convenientes en función de dicha evaluación inicial.
También resulta de interés recalcar que durante la síntesis se ha descubierto una inesperada labilidad del grupo Z (benziloxicarbonilo) en condiciones básicas muy suaves. Dicho fenómeno ha sido estudiado para una familia mucho más amplia de compuestos llegándose a la conclusión de que una asistencia anquimérica adicional proporcionada por un puente de hidrógeno entre el carbamato y una amida adyacente resulta fundamental para la desprotección de este grupo.(5) 2) Tetrapéptidos ácidos formados por D y F Afortunadamente todos los compuestos sintetizados han dado lugar a hidrogeles utilizando el cambio de pH como estímulo externo. Dichos hidrogeles han sido estudiados minuciosamente utilizando técnicas como la resonancia magnética nuclear, dicroísmo circular, microscopía de transmisión y de barrido, espectroscopia de infrarojo, fluorescencia, etc. Mediante este completo estudio se comprobó el efecto que causaba la disposición de los aminoácidos en esta cadena ya que dan lugar a redes fibrilares de morfologías y propiedades muy distintas.
La combinación de los resultados experimentales con los modelos teóricos propuestos nos ha permitido observar el papel que tanto las interacciones hidrófobicas como aromáticas desempeñan en el proceso de agregación disponiendo bloques segregados de aminoácidos polares y no polares para los mejores hidrogelantes.
Continuando con los hidrogeles tetrapeptídicos se ha llevado a cabo un estudio referente a la termodinámica y cinética del proceso de fibrilación, a menudo aspectos no considerados durante la descripción de nuevos hidrogelantes. Se han determinado para ello constantes de solubilidad y acidez detectándose un aumento general del valor de pKa (en comparación con el pKa del ácido aspártico en disolución) a consecuencia de la agregación que permite la obtención de hidrogeles a valores de pH cercanos a la neutralidad. Estas diferencias de pKa están directamente relacionadas con la termodinámica de agregación. Por otro lado los estudios cinéticos nos han permitido detectar un periodo de inducción previo a la agregación para todos los compuestos aunque con diferencias significativas entre ellos. Dicho periodo contiene el tiempo necesario para alcanzar el valor de pH que da lugar a fibrilación (termodinámica) y además otro período en el cual se encuentran presentes especies metastables. Mediante experimentos de fluorescencia se ha detectado que el paso determinante en el proceso de fibrilación resulta ser la formación de dímeros probablemente debido a la energía de activación asociada a la reorganización estructural. Como consecuencia del conocimiento tanto termodinámico como cinético de estos sistemas se ha conseguido obtener geles metaestables en presencia de otros compuestos que forman agregados termodinámicamente más estables pero que permanecen en disolución (self-sorting cinético).
Teniendo en cuenta el papel que los péptidos pequeños desempeñan tanto como modelos o inhibidores de la agregación amiloide se ha decido probar la interacción entre los tetrapéptidos ácidos y el péptido amiloide Ab1-40 obteniendo resultados satisfactorios para al menos dos de los compuestos que parecen funcionar como semillas (núcleos) para la agregación del péptido amiloide. Comparando nuestros resultados con otros previamente publicados resulta importante destacar que nuestros compuestos son de pequeño tamaño (cuatro aminoácidos) y además no poseen ningún fragmento contenido en dicha proteína.
3) Tetrapéptidos básicos formados por K y F Tras el estudio de los tetrapéptidos ácidos se han sintetizado dos análogos tetrapépticos básicos (7-8) que contienen lisina (K) en lugar de ácido aspártico (D). Además de formar geles en agua básica se ha logrado la coagregación a valores de pH neutros con los compuestos 1 y 2 utilizando para ello interacciones no covalentes. La metodología utilizada para ello ha sido mediante la inyección de sus componentes por separado en disolución dando lugar a hidrogeles homogéneos y transparentes con características idóneas para potenciales aplicaciones biológicas.
Utilizando el mismo concepto se han desarrollado además geles multi-componente capaces de mantener su estabilidad macroscópica en todo el rango de pH. Dicho comportamiento es debido al intercambio que se establece entre redes co-agregadas de dos componentes a pH neutro y redes formadas por un solo compuesto a valores ácidos o básicos de pH.
La singularidad de este sistema ha sido aprovechada para la liberación controlada de algunos colorantes teniendo en cuenta por un lado la estructura molecular de dichos compuestos y por otro lado las características particulares que presentan las diferentes redes co-ensambladas.
- 4) Tripéptidos anfifílicos formados por P, F y E Por último, las propiedades catalíticas de la prolina en sitemas autoensamblados han sido ampliamente estudiadas, en colaboración con el profesor Ashkenasy de la Universidad Ben Gurinon (Israel), atendiendo a los precedentes publicados por el grupo.(6) Para ello se han utilizado los compuestos de prolina anteriormente descritos en reacciones de condensación aldólica mostrando una clara influencia de la hidrofobicidad proporcionada por la cadena alifática del extremo C-terminal. Aquellos compuestos que formaron redes fibrilares en agua resultaron activos en la formación de enlaces C-C mientras que los compuestos que permanecieron en disolución resultaron inactivos. Estos sistemas catalíticos demuestran pues la emergencia de propiedades catalíticas debidas al autoensamblaje. Además el orden en la secuencia de aminoácidos influyó en los resultados obtenidos sugiriendo la formación de sitios catalíticos de diferente accesibilidad. Dichos compuestos sirvieron además de modelos para decapéptidos de secuencia semejante que resultaron también ser activos en reacciones aldólicas. Finalmente y tras conocer las propiedades catalíticas des estos compuestos se probó su efectividad en la obtención de productos biológicamente más relevantes de tipo carbohidratos.
III. Conclusiones En resumen, durante el transcurso de la presente tesis doctoral se han diseñado y sintetizado con éxito nuevos hidrogelantes basados en péptidos anfipáticos de pequeño tamaño. Ambas metodologías empleadas para ello, tanto en disolución como en fase sólida han dado lugar a resultados satisfactorios pudiendo obtener los productos con elevado grado de pureza y suficiente en cantidad.
El estudio del proceso de agregación desarrollado sobre todo para los tetrapéptidos ácidos ha permitido poner de manifiesto lo importante que resulta el balance hidrofóbico/hidrofílico en el modo de agregación y propiedades de los sistemas finales. Profundizar en la termodinámica y cinética de este proceso ha permitido además discernir la etapa limitante del mismo y utilizar dicho conocimiento para la elaboración de sistemas multi-componente más complejos basados en especies termodinámicamente metaestables. Dichos estudios resultan de gran utilidad considerando que los péptidos son considerados buenos modelos de la agregación amiloide y que los fenómenos que aquí se presentan pueden observarse e incluso magnificarse en sistemas proteicos de mayor tamaño. Por otro lado el co-ensamblaje entre dos compuestos opuestamente cargados ha permitido obtener geles cuya estabilidad se extiende a todo el rango de pH. Dichos sistemas resultan de gran utilidad biológica puesto que pueden formarse a pH neutro sin necesidad de calentar o aplicar ningún otro estímulo externo simplemente mediante la mezcla de sus componentes por separado en disoluciones acuosas. Además se ha logrado modular la liberación de ciertos colorantes atendiendo a la estructura del mismo y de la red fibrilar que lo contiene.
Finalmente la aparición de propiedades catalíticas debidas al auto-ensamblaje ha sido demostrada para derivados anfifílicos que contienen prolina como fragmento funcional. La aparición de nuevas propiedades a consecuencia del autoensamblaje así como el papel fundamental que él mismo desempeña en la formación de compartimentos aislados confiere relevancia prebiótica a estos pequeños sistemas peptídicos agregados. Los resultados obtenidos contribuyen pues al mejor entendimiento de este complejo proceso que representa la fibrilización.
IV. Referencias 1. a) Knowles, T. P. J.; Vendruscolo, M.; Dobson, C. M., The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2014, 15, 384-396; b) Hamley, I. W., The amyloid ß peptide: A chemist's perspective role in Alzheimer's and fibrillization. Chem. Rev. 2012, 112, 5147-5192.
2. a) Lakshmanan, A.; Cheong, D. W.; Accardo, A.; Di Fabrizio, E.; Riekel, C.; Hauser, C. A. E., Aliphatic peptides show similar self-assembly to amyloid core sequences, challenging the importance of aromatic interactions in amyloidosis. Proc. Natl. Acad. Sci. 2013, 110, 519-524; b) Gazit, E., Self assembly of short aromatic peptides into amyloid fibrils and related nanostructures. Prion 2007, 1, 32-35; c) Hamley, I. W., Peptide fibrillization. Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 8128-8147; d) Gazit, E., Mechanisms of amyloid fibril self-assembly and inhibition. FEBS J. 2005, 272, 5971-5978.
3. a) Dasgupta, A.; Mondal, J. H.; Das, D., Peptide hydrogels. Rsc Advances 2013, 3, 9117-9149; b) Jonker, A. M.; Löwik, D. W. P. M.; van Hest, J. C. M., Peptide- and Protein-Based Hydrogels. Chem. Mater. 2012, 24, 759-773.
4. Escuder, B.; Miravet, J.F., Functional Molecular Gels. RSC 2013; pp 001-319.
5. Tena-Solsona, M.; Angulo-Pachón, C. A.; Escuder, B.; Miravet, J. F., Mechanistic insight into the lability of the benzyloxycarbonyl (Z) group in N-protected peptides under mild basic conditions. Eur. J. Org. Chem. 2014, 3372-3378.
6. a) Berdugo, C.; Miravet, J. F.; Escuder, B., Substrate selective catalytic molecular hydrogels: the role of the hydrophobic effect. Chem. Commun. 2013, 49, 10608-10610; b) Rodríguez-Llansola, F.; Miravet, J. F.; Escuder, B., A supramolecular hydrogel as a reusable heterogeneous catalyst for the direct aldol reaction. Chem. Commun. 2009, 7303-7305.
