Resumen de Síntesis y evaluación biológica de híbridos de combretastatina a-4 y colchicina con análogos de pironetina
INTRODUCCIÓN La tubulina es una proteína heterodimérica que se encuentra en las células eucariotas y que consta de dos subunidades muy similares (alfa y beta). Los dímeros de tubulina se unen longitudinalmente para formar polímeros lineales (protofilamentos). Éstos a su vez forman los microtúbulos, que son los principales componentes del huso mitótico, además de ejercer una función estructural formando parte del citoesqueleto. Los microtúbulos se encuentran en un constante equilibrio dinámico de polimerización y despolimerización, conocido como inestabilidad dinámica. Los compuestos, naturales o sintéticos, capaces de alterar este dinamismo tienen un efecto antimitótico ya que son capaces de bloquear la mitosis y la división celular, y encuentran aplicación clínica como agentes quimioterapéuticos. Entre ellos destacan el taxol y los alcaloides de la vinca.1 Otra interesante diana farmacológica para el tratamiento del cáncer la presentan los compuestos con capacidad antiangiogénica. Se denomina angiogénesis al proceso de formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de la vasculatura preexistente. Una proteína clave en la angiogénesis es el VEGF Factor de Crecimiento Vascular Endotelial (VEGF) que se une a receptores VEGF-R en la superficie de las células endoteliales promoviendo una cascada de señalización que provoca la formación de nuevos vasos sanguíneos.
La colchicina fue aislada de las hojas de Colchicum autumnale. Este alcaloide viene siendo utilizado en medicina desde el siglo XVIII. En la actualidad se emplea en el tratamiento de la gota2 y en otras enfermedades inflamatorias como la fiebre mediterránea familiar (FMF). En 1998, Downing y Nogales propusieron la colocación de la colchicina en la interfase entre las subunidades de ¿- y ß-tubulina. En 2004 Ravelli y colaboradores consiguieron determinar, mediante cristalografía de rayos X, la ubicación de la colchicina en el dominio intermedio de la ß-tubulina, al lado del dominio GTP de la subunidad de ¿-tubulina.
La combretastatina A-4 (CA-4) fue aislada de la corteza del árbol Combretum caffrum en el Sur de África e India y exhibe elevada actividad antitumoral. Este compuesto ejerce su acción antimitótica uniéndose a la tubulina en el sitio colchicina.3 La CA-4 presenta una potente actividad citotóxica contra una gran variedad de líneas tumorales humanas, incluyendo las multirresistentes.4 La combretastatina A-4 también exhibe propiedades antiangiogénicas.
La pironetina es un metabolito secundario que fue aislado a partir de Streptomyces sp. NK-10958 y de cultivos de fermentación de Streptomyces prunicolor PA-48153. La pironetina exhibe capacidad reguladora del crecimiento vegetal, así como actividad inmunosupresora y antitumoral.5 La pironetina es un potente inhibidor de la polimerización de tubulina, provocando detención del ciclo celular en la fase de mitosis y muerte celular mediante apoptosis. Su acción antimitótica se debe a su interacción con la subunidad ¿ de la tubulina. Los estudios de estructura-actividad de la pironetina han determinado que ésta ejerce su acción mediante unión covalente con el residuo Lis352 del segmento de ¿-tubulina, situado a la entrada de un pequeño hueco frente a la unidad de ¿-tubulina.
La idea central del proyecto de esta investigación es la concepción, diseño y síntesis de estructuras orgánicas no naturales pero emparentadas con las mismas, que muestren interacciones importantes con proteínas clave de las células del organismo humano. El objetivo es conseguir estructuras que muestren una actividad biológica antitumoral mejorada o similar a la de los productos de los que derivan pero con una estructura más sencilla, que haga más económica su síntesis.6 METODOLOGÍA 1) Se ha llevado a cabo la síntesis de híbridos, constituidos por un fragmento de combretastatina A-4 unido a un fragmento de dihidropiranona (estructura similar a la pironetina) mediante un espaciador que contiene un anillo de triazol.
2) Se ha llevado a cabo la síntesis de híbridos, constituidos por un fragmento de colchicina unido a un fragmento de dihidropiranona (estructura similar a la pironetina) mediante un espaciador de tipo amidoéster.
3) Se ha estudiado la citotoxicidad de ambas familias de híbridos sobre las líneas celulares tumorales de adenocarcinoma de colon (HT-29), adenocarcinoma de mama (MCF7) y la línea sana de células embrionarias de riñón (HEK-293) 4) Sobre una selección de compuestos de ambas familias de híbridos, basada en su capacidad antimitótica y antiproliferativa, se ha estudiado su capacidad antiangiogénica mediante inhibición del factor de crecimiento vascular endotelial VEGF y del gen VEGF que lo codifica.
5) Sobre una selección de compuestos de ambas familias de híbridos, basada en su capacidad antimitótica y antiproliferativa, se ha estudiado su capacidad antitelomerasa mediante inhibición de la expresión del gen hTERT y del gen c-MYC.
6) Se han llevado a cabo estudios de interacción con tubulina de una selección de los compuestos, junto con sus precursores.
7) Se han realizado ensayos de citotoxicidad en la línea tumoral de cáncer de ovario A2780 y su variante resistente A2780AD Se han realizado experimentos de ciclo celular para determinar la capacidad de acumulación de células en la fase del ciclo celular G2/M.
8) Se ha estudiado el efecto que los compuestos sintéticos ejercen sobre la concentración crítica (Cr) de tubulina necesaria para conseguir la polimerización de esta proteína in vitro.
CONCLUSIONES 1) Se ha llevado a cabo en el laboratorio la síntesis de veinticuatro compuestos orgánicos. Doce de los compuestos son híbridos de combretastatina A-4 con análogos simplificados de pironetina. La unión de los fragmentos se ha llevado a cabo mediante una reacción de cicloadición 1,3-dipolar entre un alquino terminal y una azida, lo que ha permitido la conexión de ambos fragmentos mediante una anillo de triazol. Los otros doce híbridos contienen un fragmento de colchicina conectado a análogos simplificados de pironetina mediante una espaciador de tipo amidoéster.
2) Todos los compuestos sintéticos muestran valores de citotoxicidad en el rango micromolar en las líneas celulares tumorales HT-29, MCF7 y HEK-293.
3) Los compuestos más potentes en la inhibición del gen VEGF son 4.9a (94%), 4.9c (97%) y 4.12c (92%) y los mejores inhibidores de la proteína VEGF son 4.9a (55%), 4.12a y 4.12c (56%) 4) Los compuestos más potentes en la inhibición del gen hTERT son 4.9c (81%) y 4.12c (58%) y los mejores en la inhición del gen c-MYC son ent-3.1a (76%), 4.9a (84%), 4.9c (95%) y 4.12c (85%).
5) La citotoxicidad de los compuestos en las líneas celulares A2780 y su variante resistente A2780AD cae en rango micromolar, excepto los compuestos 4.9a y 4.12c que son mucho más activos y exhiben citotoxicidades en el orden nanomolar en la línea sensible.
6) De los ensayos de ciclo celular se concluye que los híbridos que presentan un fragmento de colchicina (4.9a-4.9d, 4.10a-4.10d y 4.12a-4.12d son capaces de acumular células en fase G2/M a concentraciones de entre 5-10 µM.
7) Los híbridos que poseen la parte combretastatina A-4 (3.31a-3.31d) unida al fragmento de pironetina de tres estereocentros también son capaces de acumular células en fase G2/M.
8) En los ensayos de concentración crítica e tubulina (Cr) de tubulina, los valores más altos los presentan los compuestos 3.31a y 4.9c. Por otro lado, el compuesto 4.12c presenta valores de Cr inferiores a los del control, lo que podría indicar un ligero carácter estabilizante de microtúbulos.
BIBLIOGRAFÍA 1. Sarabia, F.; García-Catro, M.; Sánchez-Ruiz A. Current Bioactive Compounds, 2006, 2, 269-299.
2. http://www.idph.state.il.us/ 3. Sackett, D. L. Pharmacol. Ther. 1993, 59, 163-228.
4. McGown, A. T.; Fox, B. W. Cancer Chemother. Pharmacol. 1990, 26, 79-81.
5. Para patentes relacionadas con el uso de pironetina (PA-48153C) y derivados simples como herbicidas, inhibidores de la angiogénesis, inmunosupresores y antitumorales, véase: (a) Kurokawa, T.; Kobayashi, K.; Tsucha, K.; Hayaoka, T.; Shida, A.; Masui, A.; Nakagawa, T. Jpn. Kokai Tokkyo Koho, Appl. 91-197320 19910712, 1993. (b) Yoshida, T.; Koizumi, K.; Kawamura, Y.; Matsumoto, K.; Itazaki, H. Eur. Pat. Appl. 93-104086 19930312, 1993. (c) Kawada, K.; Yasui, T.; Koizumi, K.; Matsumoto, T. Jpn. Kokai Tokkyo Koho, Appl. 95-108698 19950502, 1996. (d) Nagata, H.; Usui, T.; Kobayashi, S.; Tsuchiya, K.; Nishikawa, K. Jpn. Kokai Tokkyo Koho, Appl. 97-155364 19970612, 1999. (e) Seno, C.; Okada, M.; Tsuchiya, K.; Kitagawa, M.; Abe, S. Jpn. Kokai Tokkyo Koho, Appl. 99-243824 19990830, 2001.
6. Para publicaciones de nuestro grupo sobre síntesis de análogos de pironetina y evaluación antimitótica véase: a) Marco, J. A.; García-Pla, J.; Carda, M.; Murga, J.; Falomir, E.; Trigili, C.; Notararigo S.; Díaz, J. F.; Barasoain, I. Eur. J. Med. Chem. 2011, 46, 1630-1637. b) Carda, M.; Murga, J.; Díaz-Oltra, S.; García-Pla, J.; Paños, J.; Falomir, E.; Trigili, C.; Díaz, J. F.; Barasoain, I.; Marco, J. A. Eur. J. Org. Chem. 2013, 6, 1116-1123. c) Paños, J.; Díaz-Oltra, S.; Sánchez-Peris, M.; García-Pla, J.; Murga, J.; Falomir, E.; Carda, M.; Redondo-Horcajo, M.; Díaz, J. F.; Barasoain, I.; Marco, J. A. Org. Biomol. Chem. 2013, 11, 5809-5826.
