Síntesis de fucosil-oligosacáridos, evaluación de sus propiedades bioactivas y caracterización de sus rutas metabólicas en Lactobacillus

• Autores: Jimmy Everth Becerra Enríquez
• Directores de la Tesis: María Jesús Yebra Yebra (dir. tes.), Vicente Monedero García (codir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de València ( España ) en 2016
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Julio Polaina Molina (presid.), María Teresa Martínez Pastor (secret.), Juan Miguel Rodríguez Gómez (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina y Biotecnología por la Universitat de València (Estudi General)
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TESEO  RODERIC 
• Resumen

  • Los fucosil-oligosacáridos (FUS) son carbohidratos que contienen fucosa y constituyen más del 50% de los oligosacáridos libres presentes en la leche humana, sin embargo su función fisiológica es mayormente desconocida. Los FUS forman parte también de muchos glico-complejos presentes en las mucosas y en la superficie de células eucariotas. Se ha evidenciado que las características estructurales que presentan estos carbohidratos se relacionan con funciones biológicas importantes, entre las cuales destacan el efecto prebiótico y la actividad anti-adhesiva contra patógenos intestinales. A pesar de que la participación de los FUS en muchas funciones biológicas es esencial, éstos permanecen relativamente inaccesibles a la investigación científica y farmacéutica debido a las dificultades inherentes a su síntesis. Por lo tanto, los objetivos generales que se abordan en este trabajo son la producción y purificación de FUS a escala semi-preparativa mediante síntesis enzimática, la determinación de sus propiedades bioactivas (efecto prebiótico y actividad anti-adhesina) y el estudio de las rutas metabólicas implicadas en la utilización de estos carbohidratos y sus monosacáridos constituyentes (L-fucosa) en microorganismos probióticos. Las ?-L-fucosidasas AlfB y AlfC aisladas de Lactobacillus casei se han utilizado previamente en reacciones de transfucosilación para sintetizar los disacáridos fucosil-?1,3-N-acetilglucosamina (Fuc-?1,3-GlcNAc) y fucosil-?1,6-N-acetilglucosamina (Fuc-?1,6-GlcNAc), que forman parte de glicanos presentes en la leche humana. En esta Tesis Doctoral se han escalado esas reacciones y se han purificado los disacáridos mediante cromatografía semi-preparativa, obteniéndose unos rendimientos del 30% para el Fuc-?1,3-GlcNAc y del 65% para el Fuc-?1,6-GlcNAc. AlfC se ha utilizado además en reacciones de transfucosilación con azúcares aceptores diferentes a la GlcNAc, obteniéndose los siguientes FUS: el glicoaminoácido fucosil-?1,6-N-acetilglucosamina-asparagina (Fuc- GlcNAc-Asn), los disacáridos fucosil-glucosa, fucosil-galactosa y el trisacárido fucosil-N,N’-diacetilquitobiosa. Por otro lado, mediante mutagénesis aleatoria y dirigida se obtuvieron 18 variantes de la enzima AlfB. Cuatro de ellas, los mutantes M58, M75, M78 y M79, presentaron un rendimiento de transfucosilación superior al 50% para la síntesis de Fuc-?1,3-GlcNAc, destacando la variante M58 con la cual se logró obtener el máximo rendimiento posible (cercano al 100%), representando una mejora del 70% con respecto a la enzima silvestre. Los dos fucosil-GlcNAc disacáridos sintetizados se utilizaron para evaluar el potencial efecto prebiótico en diferentes cepas de Lactobacillus y Bifidobacterium. Se observó que 6 de las 11 cepas ensayadas de Lactobacillus casei, y 2 de las 6 cepas ensayadas de Lactobacillus rhamnosus fueron capaces de fermentar el disacárido Fuc-?1,3-GlcNAc. Además, la cepas BL87 de L. casei y BL327 de L. rhamnosus fermentaron Fuc-?1,6-GlcNAc. Las especies Bifidobacterium breve y Bifidobacterium pseudocatenulatum también metabolizaron el disacárido Fuc-?1,3-GlcNAc. A su vez, ambos fucosil-disacáridos se ensayaron por su potencial anti-adhesivo frente a cepas enteropatógenas de Escherichia coli (EPEC) aisladas de niños con gastroenteritis. Se observó que ambos disacáridos inhiben la adhesión en diferentes niveles de algunas cepas EPEC a células epiteliales humanas (línea HT-29). La cepa probiótica L. rhamnosus GG (LGG) es capaz de utilizar la L-fucosa como fuente de carbono y en su metabolismo está implicado el operon fuc, que contiene genes que codifican para una permeasa de L-fucosa (fucP), para la ruta catabólica de esta hexosa (fucI, fucK, fucU y fucA) y para un regulador transcripcional (fucR). Análisis transcripcionales demostraron que el operon fuc está inducido por L-fucosa a través de FucR, que actúa como un activador transcripcional. LGG metaboliza el disacárido Fuc-?1,3-GlcNAc y a diferencia de otros lactobacilos que excretan la L-fucosa al medio, la presencia del operon fuc le permite utilizar la L-fucosa que forma parte de ese disacárido. Por último, se ha demostrado que la cepa L. casei BL23 es capaz de utilizar el glicoaminoácido Fuc-GlcNAc-Asn sintetizado aquí y que el operón alf2 está implicado en su metabolismo. Este operón contiene los genes alfHC, que codifican para una permeasa y para la ?-L-fucosidasa AlfC mencionada arriba, respectivamente, y en dirección opuesta se encuentran los genes anotados como asdA, alfR2, pepV, asnA2 y sugK que codifican para las siguientes proteínas hipotéticas: una aspartato descarboxilasa/aminotransferasa, un regulador transcripcional, una peptidasa V, una glicosilasparaginasa y una azúcar quinasa, respectivamente. Análisis fenotípicos de mutantes para esos genes y análisis transcripcionales sugirieron que ambos clusters de genes están inducidos por el Fuc-GlcNAc-Asn a través de la inactivación del represor AlfR2. El conjunto de todos estos resultados demuestra que la capacidad de algunos lactobacilos para adaptarse al tracto gastrointestinal humano se correlaciona en parte con la presencia de genes involucrados en el transporte y catabolismo de FUS, los cuales son abundantes en este nicho particular. Además, las ?-L-fucosidasas de L.casei BL23, responsables de la hidrólisis de estos compuestos fucosilados, también han mostrado ser altamente eficientes en su síntesis. Esto ha permitido determinar su potencial prebiótico con diferentes cepas de Lactobacillus y Bifidobacterium, así como también su actividad antiadhesiva contra patógenos intestinales.