Resumen de Role of myosin-1a in colorectal cancer
INTRODUCCIÓN La pérdida de polaridad celular, diferenciación y arquitectura de los tejidos son características distintivas de los tumores sólidos avanzados y se correlacionan fuertemente con un mayor potencial metastático y mal pronóstico de los pacientes (Wodarz and Nathke, 2007). Los mecanismos que regulan esta transición epitelio-mesenquimal (EMT) están bien caracterizados (Thiery, 2002), sin embargo la importancia de la pérdida de la polaridad celular y diferenciación en las primeras etapas de la tumorigénesis epitelial no están bien definidas. Datos recientes en organismos modelo indican que los genes que regulan la polaridad celular y la diferenciación en las células epiteliales pueden tener actividad supresora de tumores en las etapas iniciales del proceso oncogénico, aunque el papel de los reguladores de la polaridad en el cáncer humano no ha sido investigado a fondo (Partanen et al., 2009, Wodarz, 2000, Wodarz and Nathke, 2007).
Las células absortivas del epitelio intestinal se caracterizan por tener un fenotipo polarizado: en la parte apical muestran una estructura llamada ¿borde del cepillo¿ (en inglés: brush border) que consiste en una matriz de microvellosidades digitiformes que aumentan significativamente la superficie de contacto con el lumen intestinal. La estructura de cada microvellosidad es mantenida por un eje central de filamentos de actina entrecruzados por las proteínas estructurales Fimbrina, Villina y Espin. La proteína Miosina-1a (MYO1A) une los filamentos de actina a la membrana del enterocito (Chantret et al., 1988, West et al., 1988).
Generalmente se considera que la pérdida de las proteínas estructurales que forman el complejo citoesqueleto del borde del cepillo es una consecuencia de la desdiferenciación y pérdida de polarización que ocurre durante la progresión tumoral. Nunca ha sido observado un papel causal de estas proteínas en el proceso tumorigénico del cáncer colorrectal.
OBJETIVOS El objetivo principal de este trabajo de tesis fue estudiar el papel de la proteína del brush border Myosina-1a (MYO1A) en el proceso tumorigénico colorrectal. En particular, los objetivos principales del estudio fueron: ¿ Estudiar la presencia de mutaciones en MYO1A en tumores primarios y líneas celulares de cáncer de colon y recto, y en su caso, investigar los efectos biológicos de las mutaciones encontradas.
¿ Estudiar la presencia de eventos epigenéticos como posible mecanismo de regulación de la expresión de MYO1A en cáncer colorrectal.
¿ Estudiar el papel de MYO1A en la progresión del tumor, mediante: a) modelos in vitro, regulando los niveles de MYO1A en líneas celulares de cáncer colorrectal y estudiando el fenotipo de las células cancerosas, (diferenciación, polarización, motilidad y crecimiento del tumor); b) modelos in vivo, estudiando de la tumorogénesis intestinal del ratón knockout de myo1a.
¿ Evaluar el posible uso de MYO1A como nuevo marcador biológico para el pronóstico en pacientes con cáncer colorrectal.
RESULTADOS MYO1A es frecuentemente mutada en tumores colorrectales con inestabilidad de microsatélites. Los tumores MSI (MicroSatellite Instability) son un subgrupo de tumores colorrectales que se caracterizan por acumular mutaciones en los microsatélites (repeticiones de mono- o dinucleotidos) del genoma, debido a defectos en los mecanismos de reparación del ADN. Estas mutaciones pueden ocurrir en regiones codificantes de genes supresores de tumores, inactivándolos. Si la mutación confiere una ventaja de crecimiento a las células cancerosas, se encuentra con alta frecuencia en los tumores.
En este estudio se encontraron mutaciones de cambio de pauta de lectura (frameshift) en un microsatélite constituido por 8 adeninas (A8) situado en el último exón de MYO1A, con una frecuencia del 44,4% (16/36) en líneas celulares de cáncer colorrectal MSI y 31,3% (42/134) en los tumores primarios. La mutación es específica de los tumores ya que está ausente en los correspondientes tejidos normales. Además, la frecuencia de mutaciones encontrada en MYO1A está por encima de la frecuencia de mutaciones esperada por azar en tumores colorrectales MSI, lo que sugiere que las mutaciones observadas en MYO1A son seleccionadas de forma clonal y confieren una ventaja al crecimiento de estos tumores. MYO1A se encuentra mutado en el 19% de las lesiones premalignas (adenomas) y los tumores que no han invadido a través de la pared intestinal (Dukes A) frente al 35% de los tumores que habían invadido a través de la pared del intestino y / o metástasis a los ganglios linfáticos regionales u órganos distantes (Dukes B-D, prueba exacta de Fisher, p = 0,04) lo que sugiere que la inactivación de MYO1A es importante para la invasión tumoral local a través de la pared intestinal, pero no confiere un mayor potencial metastásico.
Más del 95% de las mutaciones observada en MYO1A consisten en la delección de una adenina en un microsatélite A8 (MYO1AA7MUT) que tienen un efecto de corrimiento de la pauta de lectura, afectando a la localización subcelular de MYO1A, que pasa de localizarse de la membrana al citoplasma.
La hipermetilación del promotor regula la expresión MYO1A. La hipermetilación del promotor es un mecanismo epigenético de inactivación de genes supresores de tumores (Esteller, 2007). A pesar de la ausencia de una isla CpG densa en el promotor MYO1A, que constituye la diana típica de metilación en cáncer, se estudiaron los niveles de metilación en dos dinucleótidos CpG situados a -154bp y +271 pb respecto al sitio de inicio de la transcripción. Se observó frecuente metilación en un panel de 46 líneas celulares de cáncer colorrectal (50% de las líneas mostraron niveles de metilación superior al 50%). Los niveles de metilación en estos dos CpGs correlacionaban positivamente entre sí (r de Pearson = 0,75, p <0,0001) y negativamente con los niveles de expresión de MYO1A en estas líneas celulares (r de Pearson =-0.54; p<0.005). Además, en una serie de 122 tumores primarios colorrectales, los niveles de metilación en estos dinucleótidos CpG correlacionaban significativamente con los niveles de expresión de MYO1A (r de Pearson =-0.41, p <0,0001). Además, tras reducir in vitro la actividad de las ADN-metiltransferasas de manera farmacológica (mediante tratamiento con 5-aza-2'-desoxicitidina) o genética (mediante supresión selectiva de las ADN-metiltransferasas DNMT1y DNMT3b), se observó una reducción en los niveles de metilación en el promotor de MYO1A que se asociaba con un aumento significativo en los niveles de expresión. En conjunto, estos resultados demuestran que la metilación del promotor MYO1A es un evento común que regula la expresión de MYO1A en los tumores colorrectales.
MYO1A regula la diferenciación y la polarización de las células de cáncer de colon. Como MYO1A es importante para la localización apical de proteínas adicionales del borde en cepillo (Tyska and Mooseker, 2004), a continuación se estudió el papel de MYO1A en la polaridad celular y/o diferenciación de las células de cáncer de colon. Células Caco2 totalmente diferenciadas, que expresan altos niveles de proteína de tipo salvaje MYO1A, cuando se transfectaron con el mutante MYO1A EGFP-tailA7MUT mostraban defectos en la acumulación de actina en el borde en cepillo apical, característica de las células polarizadas. Para investigar en más profundidad el papel de MYO1A en la polarización de las células de cáncer de colon, se utilizó la línea de cáncer de colon LS174T-W4, un clon que sobreexpresa de manera constitutiva la pseudokinasa STRAD y de manera inducible la kinasa LKB1/STK11, lo que induce un fenotipo completamente polarizado (Baas et al., 2004). Tras inhibir MYO1A mediante shRNA o transfectar el mutante EGFP-MYO1AA7MUT en las células LS174T-W4, la polarización se veía inhibida de forma significativa en comparación con los controles correspondientes. Por otra parte, la inhibición estable de MYO1A en la línea Caco2 causaba una reducción muy significativa de la actividad de la fosfatasa alcalina, de la sucrasa-isomaltasa y de la dipeptidil peptidasa-4, tres marcadores de diferenciación enterocítica . Además, la formación de las estructuras ¿domes¿, un marcador adicional de diferenciación de Caco2, (Ramond et al., 1985), también estaba significativamente reducido en las células transducidas con shMYO1A en comparación con los controles. Por otra parte, la inhibición estable de MYO1A en la línea SW403 interfería con la capacidad de estas células de diferenciarse después del tratamiento con ácido butírico, un potente inductor de la diferenciación en células de cáncer colorrectal. En conjunto, estos experimentos demuestran que MYO1A regula la polarización y la diferenciación de las células de cáncer de colon.
MYO1A inhibe el crecimiento tumoral. Para investigar la posible contribución funcional de la pérdida de MYO1A en la progresión del tumor, se investigó el papel de MYO1A en la regulación del crecimiento de las células de cáncer de colon. La inhibición estable de MYO1A en las líneas Caco2 y SW403 resultó en un aumento significativo en el número de colonias cultivadas en medio semi sólido o soft-agar en comparación con los controles, indicando una mayor capacidad de crecimiento libre de anclaje. Además, estas líneas celulares demostraron un crecimiento significativamente más rápido cuando se crecieron como xenotransplantes en ratones inmunodeprimidos. Estos resultados indican que la disminución de los niveles de MYO1A confiere una ventaja de crecimiento a las células de cáncer de colon in vivo.
La pérdida de MYO1A acelera la progresión del tumor. Para investigar en mayor profundidad más el papel de MYO1A en la tumorigénesis intestinal, se utilizó el modelo de ratón knockout (KO) de Miosina-1a. Aunque estos animales muestran importantes defectos en la estructura y composición del borde del cepillo del epitelio intestinal, la inactivación de Myo1a por sí sola no es suficiente para iniciar la tumorigénesis intestinal (Tyska et al., 2005). Por lo tanto, se inició la tumorigénesis intestinal en los ratones KO de manera genética (mediante cruce con el ratón Apcmin) o farmacológica (mediante tratamiento con azoximetano-AOM). Utilizando el modelo genético de iniciación del tumor, se observó que los animales Apcmin/+ heterocigotos para Myo1a (Myo1a+/-) sufrían una reducción de la supervivencia de un 13% (Logrank test, p = 0,02), y los animales Apcmin/+ KO homocigotos para Myo1a (Myo1a-/-) de un 35% (Logrank test, p = 0,0003,. Además, los animales Apcmin/+; Myo1a+/- y Apcmin/+; Myo1a-/- mostraron un número significativamente mayor de tumores en el intestino delgado en comparación con los animales control Apcmin/+; Myo1a+/+. Asimismo, se encontró un aumento de >2 veces en el número de adenocarcinomas infiltrantes en los ratones KO homocigotos Apcmin/+; Myo1a-/- en comparación con los animales control Apcmin/+; Myo1a+/+ (11,9% frente al 5,6%, respectivamente, prueba t de Student, p = 0,05). Como mecanismo alternativo para iniciar la tumorigénesis intestinal en los ratones KO de Myo1a se utilizó AOM mediante inyecciones semanales intraperitoneales. En buen acuerdo con los datos obtenidos con el modelo Apcmin se observó un número significativamente mayor de tumores en el intestino delgado de los ratones Myo1a-/- en comparación con los Myo1a+/+ (2,5 ± 1,3 frente a 0,8 ± 0,7 tumores por ratón, respectivamente, prueba t de Student, p = 0,001). En conjunto, estos resultados demuestran que la inactivación de Myo1a es un evento importante que contribuye a la progresión de los tumores intestinales y puede participar en la transición de adenoma a carcinoma.
Bajos niveles de MYO1A se asocian con una menor supervivencia de los pacientes con cáncer colorrectal. Puesto que la inactivación de Myo1a acelera el proceso oncogénico en modelos de ratón, se investigó la posible asociación entre los niveles de MYO1A en los tumores de pacientes con cáncer colorrectal y su pronóstico. Para ello se utilizó una serie de tumores procedentes de 155 pacientes con cáncer colorrectal localmente avanzado (Dukes C). Los niveles de MYO1A en estos tumores se evaluaron mediante tinción inmunohistoquímica en un microarray tisular. Los pacientes con bajos niveles de proteína MYO1A en el tumor tenían una supervivencia, tanto global como libre de enfermedad, significativamente menor en comparación con los pacientes con alto MYO1A tumoral (Logrank test, p = 0,004 y p = 0,009, respectivamente). El tiempo medio de recurrencia de la enfermedad en los pacientes Dukes C con bajos niveles de MYO1A fue de 1 año, en comparación con >9 años en el grupo de pacientes con altos niveles. El análisis multivariante mostró que MYO1A sigue siendo un buen marcador de pronóstico de los pacientes con cáncer colorrectal (supervivencia global y libre de enfermedad, regresión de Cox p <0,04; covariables: edad, sexo, tratamiento adyuvante, la localización del tumor y el grado).
DISCUSIÓN Las proteínas estructurales del brush border del epitelio intestinal se pierden o se reducen frecuentemente durante la progresión tumoral (Beaulieu et al., 1990, Chantret et al., 1988, West et al., 1988), y en general se cree que esto es el resultado de la pérdida de la diferenciación/polarización que acompaña este proceso. Sin embargo, los datos aquí presentados muestran que la pérdida de MYO1A participa de forma activa en el proceso tumorigénico en los tumores intestinales.
MYO1A es importante para la polarización mediada por STK11/LKB1 en las células de cáncer de colon. La quinasa STK11/LKB1 es un regulador clave de la polaridad celular en organismos eucariotas (Hong et al., 2003, Lizcano et al., 2004). En humanos, mutaciones germinales en STK11/LKB1 causan el desarrollo de pólipos hamartomatosos intestinales y predisponen al cáncer colorrectal (Hemminki et al., 1994, Peutz, 1921 ). En este trabajo de tesis se muestra que MYO1A es importante para la polarización/diferenciación dependiente de STK11/LKB1 en células de cáncer de colon.
Por otra parte, la transfección de MYO1AtailA7 en células Caco2 también interfiere con el programa de diferenciación de estas células, que también se ha demostrado que depende de STK11/LKB1 (Baas et al., 2004). La mayoría de los genes supresores de tumores que se identificaron inicialmente como causa genética de predisposición hereditaria al cáncer y que luego se encontraron frecuentemente mutados en los casos de cáncer esporádico. Sin embargo, STK11/LKB1 se encuentra inactivado con baja frecuencia en los tumores colorrectales esporádicos (Esteller et al., 2000, Trojan et al., 2000, Wang et al., 1998). Por lo tanto, la inactivación genética/epigenética de MYO1A y otras proteínas downstream de STK11/LKB1 podría explicar el escaso número de mutaciones en STK11/LKB1 observadas en los tumores colorrectales esporádicos.
La polarización apical-basal de las células epiteliales requiere una estricta y orientada regulación intracelular del tráfico de proteínas y de vesículas (Nelson and Yeaman, 2001, Wodarz, 2000)(Nelson and Yeaman, 2001, Wodarz, 2000). Puesto que miembros de la familia de Miosinas-1 son importante para la distribución selectiva de proteínas en células polarizadas (Krendel and Mooseker, 2005, Nambiar et al., 2009, Tyska and Mooseker, 2004, Muller et al., 2008), la pérdida de MYO1A puede interferir directamente con la localización subcelular de los principales mediadores de la polarización de la célula. Aunque los detalles de los mecanismos moleculares detallados que subyacen al papel de MYO1A en la polarización de STK11/LKB1 aún no se han dilucidado totalmente, se ha demostrado que STK11/LKB1 activa la proteína quinasa activada por AMP (AMPK), que a su vez fosforila la cadena ligera reguladora de Miosina 2 (MYL12B/MRLC2) (Lee et al., 2007). La fosforilación de MRLC2 parece ser necesaria y suficiente para la polarización de las células de cáncer de colon. A pesar de que no se ha demostrado que esta cadena ligera de la miosina regule directamente Miosina-1a, tanto MRLC2 (Lee et al., 2007) como MYO1A colocalizan con el citoesqueleto de actina en el borde del cepillo, constituyendo un posible vínculo entre MYO1A y polarización de las células epiteliales intestinales. Por otra parte, la pérdida de la localización de Calmodulina, dependiente de MYO1A en la membrana del borde en cepillo (Tyska et al., 2005), podría afectar el estado de fosforilación de MRLC2.
La pérdida de MYO1A es importante para los estadios tempranos de tumorogénesis intestinal. La pérdida de la diferenciación epitelial y de la arquitectura es una característica de los tumores sólidos avanzados. Sin embargo, la importancia de la pérdida de la diferenciación/polarización en los primeros estadios de la progresión tumoral no ha sido bien caracterizada. Estudios realizados en Drosophila han demostrado convincentemente que la inactivación de genes implicados en la polaridad de las células epiteliales es importante para la progresión del tumor más allá de la etapa hiperproliferativas (Jacob and Praz, 2002, Partanen et al., 2009, Wodarz, 2000, Wodarz and Nathke, 2007, Wood et al., 2007, Bilder et al., 2000). Sin embargo, se han descrito pocos casos de genes de polaridad en la tumorigénesis temprana de los vertebrados superiores. Los ratones que carecen del gen Lgl1 (larvas letal gigante 1) muestran una pérdida de la polaridad neuronal de células progenitoras y displasia cerebral grave (Klezovitch et al., 2004). Además, la reducción de expresión de los reguladores clave de la polaridad LGL, DLG y SCRIB se asocia con la progresión del tumor en los seres humanos (Cavatorta et al., 2004, Gardiol et al., 2006, Kuphal et al., 2006, Nakagawa et al., 2004, Schimanski et al., 2005).
Como ha sido mencionado previamente, la pérdida de MYO1A conduce a defectos importantes en la diferenciación de las células normales del epitelio intestinal (Tyska and Mooseker, 2004). En las células de tumor intestinal, la pérdida de MYO1A interfiere con su capacidad de polarizar y diferenciarse en respuesta al contacto célula-célula o a la activación por STK11/LKB1. Por otra parte, en los modelos de ratón, la inactivación de Myo1a parece participar en la transición de adenoma a carcinoma, ya que se observa una incidencia significativamente mayor de carcinomas localmente invasivos en el intestino de los ratones KO de Myo1a en comparación con los ratones WT en presencia de la mutación ApcMin. Sin embargo, la inactivación de Myo1a en ratones ApcMin no da lugar a un fenotipo metastásico en este modelo murino. Además, en los tumores humanos, la pérdida de MYO1A parece contribuir a la adquisición de capacidad invasiva local. Esto es consistente con la observación de que la frecuencia de mutaciones aumenta de forma significativa en los tumores a medida que progresan de adenoma benigno a carcinoma localmente invasivo (Dukes B). Sin embargo, no se observa un aumento en la frecuencia de mutación en los tumores de etapa metastática (estadio de Dukes C y Dukes D) en comparación con los tumores localmente invasivos (Dukes B). Por otra parte, no se encontraron diferencias en los niveles de expresión de la proteína MYO1A entre tumores primarios Dukes C y metástasis en los ganglios linfáticos, indicando que la pérdida de MYO1A no contribuye significativamente a la metástasis del tumor.
MYO1A es un marcador independiente de pronóstico para pacientes con cáncer colorrectal. El pronóstico de los pacientes con cáncer colorrectal depende en gran medida del grado de progresión del tumor, estadificado en función de su penetración a través de la pared intestinal y de la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos regionales o en los órganos distantes. Sin embargo, la supervivencia de los pacientes diagnosticados con tumores histológicamente indistinguibles puede variar considerablemente, enfatizando la necesidad de encontrar marcadores adicionales que permitan la estratificación de pacientes con diferente pronóstico. En nuestro estudio se muestra que los niveles de MYO1A en los tumores de pacientes con diagnóstico de cáncer colorrectal estadio C de Dukes se asocia significativamente con la supervivencia del individuo. La supervivencia libre de enfermedad de los pacientes que mostraron altos niveles de MYO1A es > 9 veces mayor que la supervivencia de los pacientes con bajos niveles (> 9,1 vs 1,0 años, respectivamente). Este dato tiene una importante aplicación clínica para el pronóstico de pacientes con cáncer colorectal. Los niveles tumorales de MYO1A evaluados por inmunotinción puede predecir la probabilidad de recurrencia de la enfermedad después de la cirugía, lo que permite una mejor estratificación de los pacientes para evaluar la necesidad real de la quimioterapia adyuvante y evitar consecuencias negativas de un sobretratamiento.
