Estudio de la respuesta a inhibidores de proteínas reguladoras de la apoptosis, análisis de la mutación en la treonina 169 de bax y validación del ensayo ex vivo y del método ms-mlpa en células leucémicas
- Autores: Ana Mª Cosialls Castel
- Directores de la Tesis: Joan Gil Santano (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2011
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Jacint Boix Torras (presid.), Avelina Tortosa Moreno (secret.), Eva González Barca (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
La tesis doctoral se divide en tres partes fundamentales, todas ellas llevadas a cabo en células primarias de leucemia linfocítica crónica (LLC) o en líneas celulares leucémicas.
La LLC es la leucemia más común en los países occidentales, se caracteriza por múltiples alteraciones genéticas y se-ha descrito que las alteraciones en las vías de la apoptosis o muerte celular programada están implicadas en la fisiopatología de esta enfermedad. Aunque en los últimos años se han dedicado muchos esfuerzos en el desarrollo de nuevas terapias, la LLC continúa siendo incurable y todavía se desconocen los eventos implicados en su iniciación y desarrollo. En esta tesis doctoral se han abordado varias estrategias de inducción de apoptosis en las células de LLC basadas en la inhibición de proteínas implicadas en la regulación de este proceso: las proteínas antiapoptóticas de la familia de BCL-2 y las proteínas inhibidoras de la apoptosis (IAPs). Para ello, las células primarias obtenidas de muestras de pacientes con LLC son incubadas ex vivo con diferentes inhibidores químicos cuya áctividad ha sido descrita en la literatura. La citometría de flujo es el método fundamental para la determinación del efecto de estas moléculas sobre la viabilidad celular. Por otro lado, en esta tesis doctoral también se analiza el efecto ex vivo a diferentes fármacos utilizados en la terapia habitual de la LLC y se estudia la respuesta en diferentes grupos de pacientes clasificados según las alteraciones cromosómicas que ,presentan y que han sido descritas como factores de pronóstico en la LLC. Además, se analiza el efecto sobre la viabilidad celular de las combinaciones de estos fármacos con los anteriores inhibidores y de la presencia de un fármaco administrado in vivo en un paciente de LLC sobre la respuesta a los inhibidores administrados ex vivo. En segundo lugar, se ha abordado el análisis de la mutación missense en la treonina 169 de la proteína proapoptótica BAX, perteneciente a la familia de BCL-2, descrita en tumores de colon y gástricos humanos, y que interfiere en su capacidad inductora de apoptosis. Para ello, se ha inducido la sobreexpresión de la proteína mutante en la línea celular leucémica Jurkat que, además, es deficiente en BAX, y se ha determinado la funcionalidad de la mutación en cuanto a afectación de la viabilidad celular así como el mecanismo molecular implicado en esta pérdida de función. Paralelamente, la línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón deficientes en BAX y BAK se ha utilizado como herramienta complementaria para el estudio. Por último, debido a la complejidad de mecanismos implicados en la fisiopatología de la LLC, la descripción de la desregulación epigenética de algunos genes implicados en la LLC y la experiencia del grupo en la utilización de la técnica de MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplification), se ha validado el método de MS-MLPA en la determinación del perfil de metilación de promotores de una batería de genes supresores de tumores. Los resultados de esta tesis pueden ayudar a comprender mejor los mecanismos reguladores de la apoptosis, especialmente en las células de LLC, así como los mecanismos genéticos y epigenéticos implicados en su patoflsiología y en la respuesta a fármacos, y aporta datos para el desarrollo de nuevas terapias y combinaciones de fármacos.
