Resumen de Bases moleculares de la estabilidad de la cápsida de los aftovirus
- español
El virus de la Fiebre Aftosa (VFA) es el agente etiológico de una enfermedad altamente contagiosa que afecta numerosas especies de importancia ganadera. Se trata de un virus sin envuelta que pertenece a la familia Picornaviridae (genero aftovirus). El genoma de VFA consiste EN una molécula de RNA monocatenario de polaridad positiva y se encuentra incluido en una cápsida proteica de morfología icosaédrica constituida por 60 copias de cada una de las 4 proteínas estructurales (VP1-VP2-VP3-VP4). Cinco protómeros constituyen un pentámero, la unidad fundamental de ensamblaje y desensamblaje de la cápsida. El pH de los endosomas celulares provoca la disociación de la cápsida en las subunidades pentaméricas, permitiendo la liberación del genoma viral. Como consecuencia de este mecanismo de penetración en las células, la cápsida de VFA es extremamente sensible a pH ácido.
Con el objetivo de analizar las bases moleculares que regulan la disociación de la cásida de VFA inducida por pH ácido, se ha aislado y caracterizado una batería de nuevos mutantes de VFA con resistencia diferencial a pH ácido. Las sustituciones aminoacídicas que alteran la estabilidad se distribuyeron preferencialmente en dos diferentes regiones de la cápsida: el extremo N-terminal de VP1 y la interfaz pentamérica. Además, el fenotipo de labilidad a pH ácido inducido por una mutación localizada en la interfaz pentamérica (VP3 A116V) fue compensado con la introducción de una sustitución localizada en extremo N-terminal de VP1 (VP1 N17D), generando el mutante doble VP3 A116V VP1 N17D. Estos resultados indican que la estabilidad del virión es el producto de la interacción de residuos de diferentes proteínas de la cápsida, y en particular los localizados en el N-terminal de VP1 o cerca de la interfaz pentamérica.
Debido a su mecanismo de desencapsidación, la replicación de VFA es inhibida por compuestos que bloquean la acidificación endosomal, como NH4Cl y Con A, existiendo una correlación entre los niveles de resistencia a NH4Cl y la labilidad a pH ácido de la cápsida de VFA. Sin embargo, esta correlación se perdió en el mutante VP3 A116V VP1 N17D, ya que a pesar de tener la misma sensibilidad a pH ácido que el virus parental, las poblaciones de este mutante fueron más resistente a NH4Cl, sin apreciarse, mediante secuenciación convencional, la imposición de variantes. Los resultados obtenidos sugieren que este fenotipo se debe a que la presencia de las mutaciones VP3 A116V y VP1 N17D incrementa la plasticidad de la cápsida de VFA, haciéndola más tolerante a otros cambios de aminoácido y por lo tanto más propensa del virus parental a seleccionar fenotipos de resistencia a NH4Cl.
Se ha descrito que la sustitución VP1 N17D, localizada en el N-terminal de VP1, incrementa la resistencia a pH ácido del virión de VFA. A partir del mutante VP1 N17D, se ha aislado un virus con una resistencia a pH ácido aún mayor que contiene una sustitución adicional (VP2 H145Y). Este mutante de VFA denominado VP2 H145Y VP1 N17D produjo viriones más estables a pH ácido, que también mostraron mayor estabilidad térmica (a 4 ̊C, la temperatura de almacenamiento de las vacunas inactivadas de VFA). Puesto que el almacenamiento prolongado a 4 ̊C o rupturas de la cadena de frío provocan la disociación de los viriones contenidos en las preparaciones de vacunas inactivadas químicamente, comprometiendo su inmunogenicidad, se procedió a evaluar la inmunogenicidad de una vacuna inactivada basada en este mutante en un hospedador natural: el cerdo. Los resultados obtenidos apoyan un posible uso de los mutantes de VFA con estabilidad a pH ácido incrementada como alternativas vacunales al virus parental.
Finalmente, con el objetivo de profundizar en el mecanismo de desencapsidación de los aftovirus, extendimos el estudios de los mecanismos que median la estabilidad de la cápsida al virus de la Rinitis Equina A (VREA), un aftovirus que provoca un cuadro respiratorio en caballos, genéticamente muy relacionado con VFA y cuya desencapsidación también ese produce en los endosomas celulares inducida por pH ácido. Como fruto de este trabajo, se ha aislado una batería de mutantes con sensibilidad a pH ácido alterada, que difieren en su grado de inhibición mediada por acidificación endosomal. Curiosamente, todas las sustituciones encontradas en los mutantes resistentes y lábiles a pH ácido se localizaron en VP3, sugiriendo que esta proteína tiene un papel fundamental en el control de la estabilidad a pH ácido de la cápsida de VREA. Además, todas estas sustituciones se localizaron en la interfaz intraprotomérica, entre VP3 y VP2 o entre VP3 y el extremo N-terminal de VP1. Estos resultados extienden nuestro conocimiento sobre las regiones que gobiernan la estabilidad a pH ácido de la cápsida de los aftovirus y se deberían tener en cuenta a la hora de usar VREA como modelo de aftovirus.
- English
Foot-and-mouth disease virus (FMDV) is the etiological agent of a highly contagious disease that affects important livestock species. FMDV is a small non-enveloped virus belonging to the Picornaviridae family (Aphthovirus genus). The FMDV genome, which consists of a positive RNA strand, is enclosed inside an icosahedral capsid built up with 60 copies of each of the four structural protein (VP1 to VP4). Five protomers associate in a pentamer, the smallest unit of assembly and disassembly of the capsid. The acidic pH inside cellular endosomes promotes the capsid dissociation in pentameric subunits and triggers virus uncoating and genome release. As a direct consequence of this mechanism of penetration in the cells, FMDV capsids are extremely sensitive to acidic pH.
We have analyzed the molecular basis of FMDV acid-induced disassembly by isolating and characterizing a panel of novel FMDV mutants differing in acid sensitivity. Amino acid replacements altering virion stability were preferentially distributed in two different regions of the capsid: the N terminus of VP1 and the pentameric interface. Even more, the acid labile phenotype induced by a mutation located at the pentameric interface in VP3 (VP3 A116V) could be compensated by introduction of an amino acid substitution in the N terminus of VP1 (VP1 N17D). These results indicated that virion stability is the fine-tuned product of the interaction between residues from different capsid proteins, in particular those located within the N terminus of VP1 or close to the pentameric interface.
As a consequence of its uncoating mechanism, FMDV infection is inhibited by drugs that block endosomal acidification such as NH4Cl and Con A. Even more, there is a correlation between the levels of NH4Cl resistance and the acid lability of the viral capsid. Nevertheless, the mutant VP3 A116V VP1 N17D, fdid not follow this correlation, because even having the same acid lability that the wildtype virus, since it was more resistant to NH4Cl and showed the same acid lability. Our results suggest that the presence of the replacements VP3 A116V and VP1 N17D increases capsid plasticity, making it more tolerant to the introduction of other substitutions and therefore more prone to select NH4Cl resistant phenotypes than the parental virus.
It has been previously reported that the substitution VP1 N17D, located in the N-terminus of VP1, increased acid resistance of FMDV virions. Using mutant VP1 N17D as a starting point, we isolated a virus with higher acid resistance carrying an additional replacement, VP2 H145Y, in a residue highly conserved among picornaviruses. The VP2 H145Y VP1 N17D virions also showed increased resistance to dissociation at 4 ̊C (the temperature for inactivated vaccine storage). Considering that long term storage at 4 ̊C or ruptures of the cold chain, provoke the dissociation of virions, reducing the immunogenicity of the vaccine, we have evaluated the immunogenicity in swine (a natural FMDV host) of a chemically inactivated vaccine based on this mutant. The presence of these amino acid substitutions did not compromise the immunological potential of this vaccine, including its ability to elicit neutralizing antibodies. These results support the feasibility of this kind of mutants with increased capsid stability as suitable seeding virus for the development of improved FMDV vaccines.
Finally, in order to extend the study of the molecular basis of the uncoating mechanism of aphthoviruses, we included in our analysis the equine rhinitis A virus (ERAV), a picornavirus associated with respiratory disease in horses and genetically closely related to FMDV. As described for FMDV, current data support that acidic pH inside cellular endosomes triggers ERAV uncoating. Accordingly, we isolated a panel of ERAV mutants with altered acid sensitivity and that differed on their degree of sensitivity to the inhibition of endosome acidification. Remarkably, all amino acid substitutions found in acid-labile or acid-resistant ERAVs were located in the capsid protein VP3, indicating that this protein plays a pivotal role for the control of pH stability of the ERAV capsid. Moreover, all amino acid substitutions mapped at the intraprotomer interface between VP3 and VP2 or between VP3 and the N terminus of VP1. These results expand our knowledge on the regions that regulate the acid stability of aphthovirus capsid and should be taken into account when using ERAV as a surrogate of FMDV.
