Detección y cuantificación de Trichoderma harzianum, y evaluación de su actividad biocontrol frente a la fusariosis vascular del melón mediante la aplicación de herramientas moleculares
- Autores: Rubén López Mondejar
- Directores de la Tesis: José Antonio Pascual Valero (dir. tes.), Margarita Ros Muñoz (codir. tes.)
- Lectura: En la Universitat d'Alacant / Universidad de Alicante ( España ) en 2011
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Carlos García Izquierdo (presid.), Antonio Roldán Garrigós (secret.), Gisela Díaz Espejo (voc.), Maria Isabel Trillas (voc.), Monika Schmoll (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: RUA
- Resumen
El control biológico de fitopatógenos es una alternativa viable para sustituir el empleo de productos químicos en agricultura. Esta medida cobra gran importancia en el campo de la agricultura ecológica, donde el uso de estos productos químicos está prohibido por la regulación europea, provocando que estos cultivos sean especialmente sensibles a diferentes patógenos. Uno de estos patógenos, Fusarium oxysporum f. sp. melonis, agente causal de la fusariosis vascular del melón, es el principal responsable de enormes pérdidas tanto a nivel de campo como durante la producción de plántula en semilleros. El problema de esta enfermedad en semillero es, si cabe, aún más importante, ya que estas instalaciones presentan las condiciones óptimas para el desarrollo de la enfermedad y dispersión del patógeno, así como la posibilidad de su traslado al campo, favoreciendo de este modo que la enfermedad se extienda.
El empleo del hongo Trichoderma harzianum ha mostrado buenos resultados como agente de control biológico (ACB) contra este fitopatógeno a nivel de semillero. La actividad de control biológico que presentan los aislados de esta especie es debido principalmente a los distintos mecanismos de acción que presentan, tales como antibiosis y competencia por nutrientes, caracterizándose además por producir una gran batería de enzimas hidrolíticas que les permite actuar como micoparásitos de otros hongos.
El empleo de estos aislados requiere, sin embargo, de herramientas que permitan no sólo la selección de aislados con un mayor potencial de control biológico o una mayor efectividad frente a una enfermedad, sino también de herramientas que permitan la monitorización del ACB, una vez inoculado en los sustratos orgánicos para el crecimiento de plántulas en semillero. A su vez, la aplicación y desarrollo de estas herramientas para la rápida detección del patógeno mejoraría enormemente el control de la enfermedad, reduciendo las posibles pérdidas y la expansión de la misma.
En los últimos años, el desarrollo de los métodos moleculares basados en el ADN y la PCR han ofrecido numerosas herramientas para el estudio en profundidad tanto de los hongos antagonistas como de los fitopatógenos. De entre estas técnicas destaca la PCR a tiempo real, la cual ofrece buenas alternativas al empleo de otros métodos clásicos como el cultivo en placa o la microscopía a la hora de monitorizar y estudiar el uso del ACB.
Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral ofrecieron un sistema molecular basado en un par de cebadores y en una sonda TaqMan para la detección y cuantificación específica de T. harzianum mediante PCR a tiempo real, tanto en cultivos puros como en sustratos orgánicos en semillero. Además, este sistema se utilizó para cuantificar la cantidad de ACB activo en el sustrato, mediante qRT-PCR. Los resultados obtenidos ofrecieron una curva de población totalmente diferente a la conseguida con qPCR y/o cultivo en placa, mostrando cómo este hongo fue capaz de desarrollarse en los medios de crecimiento de plántula bajo condiciones de semillero.
El empleo de compost inoculados con T. harzianum mostró también mejores resultados en el control de la enfermedad que el uso de turbas inoculadas con este ACB, reduciéndose la pérdida de peso y la infección por parte del patógeno. Estos resultados confirmaron que los sustratos basados en compost pueden ser buenas alternativas para controlar la fusariosis vascular del melón a nivel de semillero.
Los resultados de esta Tesis incluyeron, además, el desarrollo de un sistema TaqMan para detectar y cuantificar F. oxysporum mediante PCR a tiempo real, bajo condiciones de semillero. Este sistema permitió la detección del hongo en tejidos de la planta en los primeros estados de la infección, cuando aún no se observaban síntomas, así como la detección y cuantificación del patógeno en el sustrato. Este sistema ofreció mayor sensibilidad y rapidez, en menos de 48 h, que los métodos clásicos de cultivo en placa.
El empleo de herramientas moleculares basadas en el estudio de perfiles de amplificación del ADN (RAPD-PCR), y el estudio de expresión de genes relacionados con el proceso de micoparasitismo (qRT-PCR), junto al estudio de actividades enzimáticas codificadas por estos genes, y observaciones en placa, permitió seleccionar aislados de T. harzianum con un alto potencial biocontrol frente al patógeno F. oxysporum. La presencia de paredes celulares del patógeno activó la expresión de estos genes, siendo su perfil de expresión diferente según cada aislado. Los aislados de T. harzianum T-30 y T-78, que presentaron mayor actividad quitinasa, NAGasa y b-1,3-glucanasa, mostraron también el mayor grado de micoparasitismo cuando fueron enfrentados en placa con el patógeno.
El estudio de los perfiles de expresión de los genes relacionados con la capacidad de control biológico de T. harzianum permitió también evaluar la respuesta del sistema quitinolítico de este hongo frente a tres residuos ricos en quitina. El uso tanto de quitosano, como de harina de camarón y restos de champiñón, activaron los genes responsables de la actividad quitinolítica de este hongo. Además, nuestros resultados mostraron que el posible efecto inhibidor de algunas de estas sustancias se disipaba cuando se utilizaron como complementos de la turba en experimentos en semillero. Bajo estas condiciones de semillero, la presencia de T. harzianum y de estos compuestos aumentó la actividad quitinolítica (quitinasa y NAGasa) de los sustratos, lo cual se relacionó con un menor efecto del patógeno en las plantas, que presentaban un mayor mantenimiento del peso seco en presencia del fitopatógeno. Además se demostró que pequeñas cantidades de estos compuestos ricos en quitina adicionadas a turbas inoculadas con T. harzianum, mejoraban el crecimiento de las plántulas debido a su aporte nutricional, ofreciendo, por tanto, un valor añadido para estos residuos en el campo de la agricultura.
