Resumen de Propiedades de líquidos iónicos y su aplicación a la síntesis de nanopartículas de fibroína de seda
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RESUMEN Durante las últimas décadas, la mayoría de los procesos implicados en las industrias farmacéuticas y de química fina han requerido elevados consumos energéticos a la vez que han generado grandes cantidades de residuos. De este modo, han ido contribuyendo a la degradación medioambiental la cual de forma gradual se ha convertido en un problema global. Con esta perspectiva, los intereses medioambientales han ido creciendo y se han establecido leyes cada vez más estrictas por lo que ha surgido la necesidad de desarrollar nuevas tecnologías de menor impacto medioambiental. Es en este contexto donde surgió hace algunos años el concepto de Química Verde con el objetivo de contribuir en mayor o menor grado a la solución de dicho problema.
Uno de los principios fundamentales de la Química Verde dice literalmente que "se evitará, en lo posible, el uso de sustancias que no sean imprescindibles (disolventes, reactivos para llevar a cabo separaciones, etc.) y en el caso de que se utilicen que sean lo más inocuas posible". En este sentido, los líquidos iónicos presentan una menor toxicidad, son más seguros y menos contaminantes que los disolventes convencionales. Los líquidos iónicos son sales orgánicas que se encuentran en estado líquido a temperatura inferior a 100ºC y, desde el punto de vista medioambiental, sus propiedades más importantes son: su presión de vapor, prácticamente nula, y sus excelentes propiedades químicas y térmicas. Uno de los aspectos de mayor relevancia de los líquidos iónicos es la posibilidad de modular sus propiedades fisicoquímicas (hidrofobicidad, densidad, índice de refracción, viscosidad, punto de fusión y polaridad entre otras) mediante modificaciones en el catión y el anión constituyentes. Por estos motivos, los líquidos iónicos son conocidos como "disolventes de diseño" y presentan suficiente potencial para reemplazar los disolventes orgánicos convencionales en procesos de síntesis, catálisis y separación.
La mayoría de los líquidos iónicos no son compuestos volátiles, como consecuencia de las interacciones electroestáticas que se presentan entre los componentes de los mismos, por lo que no presentan efectos sobre la contaminación atmosférica. Sin embargo, sí que presentan un grado significativo de solubilidad en agua donde sus efectos aún no han sido estudiados en profundidad. Además, debido a su elevada estabilidad, los líquidos iónicos podrían llegar a ser agentes contaminantes persistentes en aguas residuales. Por ello, es muy importante cuantificar este efecto mediante parámetros toxicológicos como el coeficiente de reparto octanol-agua (Kow), que clasifica los líquidos iónicos en función de su hidrofobicidad o hidrofilicidad, y la toxicidad acuática (EC50).
Durante la realización de esta Tesis Doctoral se han dedicado intensos esfuerzos al estudio de las propiedades fisicoquímicas de los líquidos iónicos relacionadas con sus aplicaciones, prestando especial atención a su uso como disolventes del biopolímero fibroína de seda para sintetizar nanopartículas de fibroína de seda por primera vez a partir de soluciones fibroína de seda-líquido iónico.
En el ámbito de la nanotecnología, una partícula es definida como un pequeño objeto que se comporta como una unidad independiente en relación a sus propiedades y a su transporte. Al emplear un procedimiento específico para la liberación terapéutica de fármacos en una zona afectada, normalmente es posible encontrar muchas barreras las cuales requieren especial consideración cuando se están diseñando nuevas terapias. Así, la eficacia de cualquier terapia depende del modo de liberación y de su potencia en el área afectada. Durante las dos últimas décadas, se han desarrollado numerosos estudios en el campo de los sistemas de liberación de fármaco con el objetivo de lograr mecanismos de liberación controlada que permitan dirigir el fármaco a un tejido específico (por ejemplo, un tumor) empleando nanopartículas. Un ejemplo de sistema de liberación derivado de una estructura biológica podría estar basado en nanopartículas de fibroína de seda debido a su biocompatibilidad y degradación controlada.
La fibroína de seda del gusano Bombyx mori es una proteína biopolimérica ampliamente usada en aplicaciones biomédicas ya que presenta propiedades mecánicas similares a las de los polímeros sintéticos más avanzados. La fibroína de seda es insoluble en la mayoría de disolventes por lo que, tradicionalmente, se han empleado dos sistemas disolventes en la disolución de fibras de seda: disoluciones iónicas acuosas, como LiBr 9.3M o CaCl2 50% (w/v) y disoluciones iónicas hidroalcohólicas como la mezcla CaCl2/Etanol/Agua (reactivo de Ajisawa). Ambos tipos de disolución requieren una diálisis exhaustiva posterior y un proceso de concentración hasta el nivel requerido. Sin embargo, estos dos procesos, diálisis y concentración, implican largos tiempos y las soluciones de seda obtenidas son inestables. El empleo de líquidos iónicos para la disolución de fibroína de seda es una opción mucho más benigna que los disolventes empleados de modo convencional ya que se reduce el número total de etapas del proceso de disolución. No obstante, en este caso la disolución completa de las proteínas de la seda empleando energía térmica también puede durar varias horas, incluso aumentando la temperatura hasta unos 100 ºC, dando lugar a la pérdida de la integridad de la proteína. Por este motivo, en la presente tesis se han incorporado mejoras en el proceso de disolución de la seda aplicando energía de ultrasonidos de elevada potencia, con control de temperatura, a la mezcla fibroína de seda-líquido iónico para acelerar el proceso y evitar períodos largos de calentamiento.
Los objetivos principales de la presente tesis han sido i) el estudio de dos propiedades físicoquímicas de líquidos iónicos (densidad e índice de refracción) y de su toxicidad mediante el coeficiente de reparto octanol-agua y la toxicidad acuática y ii) la aplicación de estos líquidos iónicos como disolventes del polímero fibroína de seda para obtener nanopartículas de este material.
Los resultados obtenidos en la presente Tesis Doctoral se pueden resumir en una conclusión final afirmando que se ha profundizado en el conocimiento de las propiedades de los líquidos iónicos enriqueciendo las bases de datos disponibles y se ha conseguido un nuevo procedimiento para la disolución de las fibras de seda con líquidos iónicos mediante una técnica rápida, la cual preserva la integridad proteica y es más respetuosa con el medio ambiente, ya que pueden reciclarse los líquidos iónicos y se pueden obtener micro- o nanopartículas de tamaño controlado en función de las aplicaciones a las que vayan a ser destinadas.
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ABSTRACT During the last decades, many processes of the pharmaceutical and fine chemistry industry have involved high energy consumptions and have generated large amounts of waste. In this way, they have contributed to the high degree of environmental degradation which has gradually become a global problem. In this situation, the environmental interest has grown and the laws have become stricter and, as a consequence, new technologies of lower environmental impact have been developed. In this context, the concept of Green Chemistry emerged some years ago in order to contribute to the solution of the problem.
One of the main principles of the Green Chemistry claims literally that "the usage of unnecessary substances (solvents, reagents to carry out separation processes) will be avoided and they will be as benign as possible if they are really necessary. From this point of view, ionic liquids are less toxic, safer and more environmentally friendly than traditional organic solvents. Ionic liquids are organic salts that are liquid below 100ºC and, from an environmental point of view, their most important properties are their negligible vapour pressure and their good chemical and thermal properties. Additionally, the physicochemical properties of ionic liquids, such as their hydrophobicity, density, refractive index, viscosity, melting point, polarity and solvent properties, may be modified by altering the anion or the cation. In this sense, ionic liquids are often referred to as "designer solvents". For all of these reasons, ionic liquids have the potential to replace traditional organic solvents for synthesis, catalysis and separation purposes.
Because ionic liquids are non-volatile due to the electrostatic interactions between their components, they do not contribute to atmospheric pollution. However, they show a significant degree of solubility in water, where their full effect remains to be studied in depth. Moreover, because of their high stability, ionic liquids could become persistent pollutants in waste waters. For this reason, it is very important to quantify this effect through toxicological parameters such as the octanol-water partition coefficient (Kow), which classifies ionic liquids according to their hydrophobicity or hydrophilicity, and the aquatic toxicity (EC50).
During the development of this doctoral thesis, our research group has made an intense effort in the study of the physicochemical properties of the ionic liquids related to their applications, being especially interested in their usage as solvents of the biopolymer silk fibroin in order to synthesize silk fibroin nanoparticles from ionic liquid-silk fibroin solutions for the first time.
In nanotechnology, a particle is defined as a small object that behaves as a whole unit as regards its transport and properties. When a specific procedure is used for the therapeutic delivery of drugs into the diseased site, the barriers are numerous and require careful consideration when new therapies are being designed. The efficacy of any therapy is dependent upon its mode of delivery and its potency at the site of disease. In the last two decades, many studies have been focused on the development of drug-delivery systems to achieve controlled release mechanisms that enable drug targeting of specific tissue (e.g. tumor) sites by using nanoparticles. The silk fibroin-based delivery vehicle is an example of a biologically derived delivery system due to its biocompatibility and controlled degradation.
Silk fibroin, derived from Bombyx mori cocoons, is a widely used protein polymer for biomedical applications due to its mechanical properties which rival those of the most advanced synthetic polymers. Silks are insoluble in most solvents so, traditionally, two solvent systems have been used to dissolve silk fibres: ionic aqueous solutions, such as 9.3M LiBr or 50% (w/v) CaCl2 solution and ionic hydro-alcoholic solutions such as a CaCl2/Ethanol/Water mixture (Ajisawa's reagent). These solutions require extensive dialysis in deionized water before being concentrated to the required level. However, the processes of both dialysis and concentration are time-consuming, and the solutions obtained are unstable. The use of ionic liquids for silk fibroin dissolution is a considerably greener option than the conventional ones because the total number of steps required for the dissolution process is reduced. But the complete dissolution of silk proteins using the above described method takes several hours even with intense heating at 100 ºC, resulting in the loss of protein integrity. For this reason, in this doctoral thesis the process of silk dissolution was improved by applying high-power ultrasounds to the silk fibroin-ionic liquid mixture to accelerate the process thus avoiding long heating treatments.
The main aims of this thesis have been i) the study of some physicochemical properties of pure ionic liquids such as density and refractive index and their toxicity in terms of the octanol-water partition coefficient and the aquatic toxicity and ii) the application of these ionic liquids to the silk fibroin dissolution process to obtain silk fibroin nanoparticles.
The results obtained in this doctoral thesis can be summarized in a final conclusion: we have studied in depth some properties of ionic liquids contributing to the enlargement of databases and we have got a new process for dissolving silk fibres with ionic liquids and a faster technique which preserves the integrity of the protein and is more environmentally friendly due to the fact that the ionic liquids can be reused. In this way, micro- or nanoparticles with controlled size according to their future applications can be synthesized.
