Análisis de la expresión y función del inhibidor de antizimas 2 (AZIN2) en ratones transgénicos: estudio de nuevos ortólogos y parálogos de AZIN2
- Autores: Ana Lambertos Escudero
- Directores de la Tesis: Rafael Peñafiel García (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Murcia ( España ) en 2016
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco Solano Muñoz (presid.), Andrés Joaquín López Contreras (secret.), Francisca Sánchez Jiménez (voc.)
- Programa de doctorado: Programa Oficial de Doctorado en Integración y Modulación de Señales en Biomedicina
- Materias:
- Enlaces
- Resumen
BACKGROUND AND AIMS Polyamines are ubiquitous organic cations that play multiple essential roles in mammalian physiology. Ornithine decarboxylase (ODC) is the rate limiting enzyme in polyamine biosynthesis and it is regulated by antizymes, a family of small proteins whose synthesis is stimulated by high polyamine levels. AZs bind to ODC inhibiting its enzymatic activity and target it for degradation by the 26S proteasome. AZs are themselves regulated by another ODC-related family named antizyme inhibitors (AZINs), consisting of two members: AZIN1 and AZIN2. These proteins lack enzymatic activity but they bind to AZs with higher affinity than ODC, counteracting the effects of antizymes on ODC. AZIN1 is a ubiquitous protein that participates in the regulation of polyamine metabolism and cell growth and its disruption in mice causes death soon after birth. AZIN2 is mainly expressed in brain and testis, followed by other secretory tissues and cells. Although the physiological role of AZIN2 is mostly unknown, some data suggests that it is involved in cell growth, vesicular trafficking, secretion and spermiogenesis.
In order to study the expression pattern of AZIN2 and its physiological role in mouse, AZIN2 KO mice were generated by the insertion of a beta geo cassette, resulting in a fused protein formed by the N-terminus extreme of AZIN2 and the reporter enzyme ?-galactosidase. On the other hand, advances in genome sequencing revealed the existence of many orthologous of Azin2, and a new paralogue of Azin2 in mouse, named Gm853, whose study by transient transfected cells is a main aim of the present work. RESULTS AND CONCLUSIONS 1. Expression of the reporter gene lacZ in tissues of mice lacking Azin2.
AZIN2 KO generated mice provide qualitative and quantitative information about the expression and function of AZIN2. Hystochemical and biochemical analysis of the reporter ?-galactosidase activity in different tissues of AZIN2 KO mice confirmed significant expression of AZIN2 in epidydymis, adrenal glands, pancreas, heart, lung and eyes, in addition to testis and brain, pointing to secretory regions. However, none of the KO tissues examined showed significantly variation in polyamine content. Finally, the microarray analysis of gene differential expression between WT and KO mice did not show common changes, except the marked reduction of Azin2 expression.
2. The role of AZIN2 in male reproductive system.
Hystological sections from testis and epididymis of AZIN2 KO and WT mice showed that AZIN2 was mainly expressed in haploid cells but also in Leydig cells, suggesting that AZIN2 is required not only for the synthesis but also for the function of mature sperm cells. Besides, the sperm motility test revealed that most AZIN2 KO sperm cells were not able to move across the test medium. However, this deficiency in motor skills did not have major consequences in male fertility, as AZIN2 KO mice demonstrated to be as fertile as their WT counterparts. Finally, the deprivation of AZIN2 in male reproductive system was also associated to decreased biosynthesis and secretion of testosterone.
3. Expression and function of AZIN2 in other secretory cells and tissues. Phenotypic analysis of AZIN2 KO mice.
The role of AZIN2 in murine physiology was analysed in other secretory cells and tissues apart from testis by comparing the gain or the loss of functions in AZIN2 KO mice. In brain, AZIN2 prevails in the cerebellum and hippocampus areas and its disruption in these areas correlates with a deficient motor function in mice. The expression of AZIN2 in adrenal glands and pancreas was restricted to the adrenal medulla and to Langerhans islets, respectively. In other tissues such as heart, eyes, lung and kidney, the expression of AZIN2 was also restricted to specific types of cells. In pancreas, the absence of AZIN2 generates a slight hyperglycemia associated to impaired synthesis and secretion of insulin from ? cells.
4. Structural and functional properties of Xenopus Azin2.
Studies about ODC in Xenopus reveal the existence of two homologous proteins named XODC1 and XODC2, with different spatial and temporary patterns of expression. XODC2 appears on gene databases as XAZIN2, thus, it is considered an orthologous of mAZIN2 and hAZIN2. Unlike mAZIN2, the orthologous of AZIN2 in Xenopus laevis (xlAZIN2) is degraded by AZ1 and possesses decarboxylase activity of ornithine and lysine, showing higher affinity for lysine than for ornithine. The comparative analysis of xlAZIN2 with mODC and mAZIN2 revealed additional similarities with mODC, based on the cytosolic subcellular localization and the ability to form aggregates such as homotetramers. Similarly to mODC, xlAZIN2 stimulates agmatine uptake, decreases that of putrescine and spermidine and presents a short half-life, lower than 30 minutes.
5. Study of mouse Gm853, a new paralogue of Odc and Azin2.
Comparative analysis of protein sequences from ODC paralogues revealed GM853 as a new homologue protein of ODC and AZINs in mouse, presenting all conserved residues for enzymatic activity. Experiments with transfected cells demonstrated that GM853 is not an antizyme inhibitor as it does not prevent the interaction between ODC and AZ1. Otherwise, it is a very stable protein mainly located in the cytosol and it is able to form homodimers and homotetramers but no heterodimers with other paralogues. Besides, GM853 presents enzymatic activity, being the first decarboxylase for L-Leucine described in mammals. The expression of GM853 in mice is restricted to renal tissue with higher representation in male kidneys, related to increased levels of testosterone. The product of Leucine decarboxylation is the isopenthylamine and it is rapidly excreted with urine.
? ANTECEDENTES Y OBJETIVOS Las poliaminas son cationes orgánicos presentes en todas las células con funciones esenciales en la fisiología de todos los mamíferos. Ornitina descarboxilasa (ODC) es la enzima limitante en la biosíntesis de poliaminas y está regulada por los antizimas (AZs), una familia de pequeñas proteínas cuya síntesis es estimulada por las propias poliaminas. Los AZs se unen a ODC inhibiendo su actividad enzimática y la conducen al proteasoma 26S para su degradación. Los AZs son a su vez regulados por otra familia de proteínas relacionadas con ODC, denominadas inhibidores de antizimas (AZINs), formada por dos miembros: AZIN1 y AZIN2. Estas proteínas carecen de actividad enzimática pero se unen a los AZs con más afinidad que ODC, contrarrestando los efectos de los antizimas sobre ODC. AZIN1 es una proteína ubicua que participa en la regulación del metabolismo de poliaminas y el crecimiento celular y su abatimiento en ratones causa la muerte poco después de nacer. AZIN2 se expresa fundamentalmente en cerebro y testículos, además de otros tejidos y células secretoras. Aunque el papel fisiológico de AZIN2 no se conoce con certeza, algunos experimentos sugieren que está implicado en el crecimiento celular, el tráfico vesicular, secreción y espermatogénesis.
Con el fin de estudiar el patrón de expresión de AZIN2 y su implicación fisiológica en ratón, se generaron ratones KO de AZIN2 mediante la inserción de un cassette beta geo, que dio lugar a una proteína recombinante formada por el extremo N-terminal de AZIN2 y la enzima reportera ?-galactosidasa. Por otro lado, los avances en el ámbito de la secuenciación de genomas, han revelado la existencia de un gran número de ortólogos de Azin2, así como un nuevo parálogo de Azin2 en ratón, denominado Gm853, cuyo estudio mediante células transfectadas también es objeto de esta tesis doctoral. RESULTADOS Y CONCLUSIONES 1. Expresión del gen reportero lacZ en tejidos de ratones con abatimiento de Azin2.
El modelo de ratón transgénico con abatimiento del gen Azin2 generado, permitía el estudio de la expresión y posible función de la proteína AZIN2. El análisis histoquímico y bioquímico de la actividad ?-galactosidasa en tejidos de ratones KO de AZIN2 confirmó la expresión de AZIN2 en epidídimo, glándula adrenal, páncreas, corazón, pulmón y ojos, aparte de testículo y cerebro, apuntando a células secretoras. Sin embargo, en ninguno de los tejidos estudiados en ratones deficientes en AZIN2 se observó reducción significativa de los niveles tisulares de poliaminas. Finalmente, el estudio comparativo de la expresión de genes entre ratones WT y KO mediante microarrays, no mostró cambios comunes en todos ellos salvo la marcada reducción de la expresión de Azin2.
2. The role of AZIN2 in male reproductive system.
El análisis histoquímico de secciones de testículos y epidídimos WT y KO de AZIN2 mostró que AZIN2 se expresa fundamentalmente en células haploides, pero también en las células de Leydig, sugiriendo su participación no solo enla síntesis sino también en la maduración de los espermatozoides. Además, el test de movilidad espermática mostró que la mayoría de los espermatozoides KO de AZIN2 no eran capaces de desplazarse en el medio de ensayo. Sin embargo, esta deficiencia en la motilidad no tuvo consecuencias en la fertilidad de los ratones machos, demostrando ser tan fértiles como los WT. Finalmente, el abatimiento de AZIN2 en el aparato reproductor masculino se asoció a una disminución en la biosíntesis y la secreción de testosterona. 3. Expresión y función de AZIN2 en otros tejidos y células secretoras. Análisis fenotípico de los ratones KO de AZIN2.
El papel de AZIN2 en la fisiología murina en otros tejidos que expresan AZIN2 se analizó comparando los cambios sobre la función en ratones KO de AZIN. En el cerebro de ratón, AZIN2 predomina en el cerebelo y en el hipocampo y su disrrupción en estas áreas está relacionada con un una función motora deficiente. La expression de AZIN2 en la glándula adrenal y el páncreas se limitó a la médula adrenal y a los islotes de Langerhans, respectivamente. En otros tejidos como corazón, ojos, pulmón y riñón, la expression de AZIN2 se concentró en tipos de células específicas. En páncreas, la ausencia de AZIN2 genera una ligera hiperglucemia porque afecta a la síntesis y secreción de insulina por las células ?.
4. Propiedades estructurales y funcionales de Azin2 de Xenopus.
El estudio de ODC en Xenopus reveló la existencia de dos proteínas homólogas denominadas XODC1 y XODC2, con diferente patró de expresión espacial y temporal. XODC2 aparece en las bancos de genes como XAZIN2, siendo considerado un ortólogo de mAZIN2 y hAZIN2. Al contrario que AZIN2 de ratón, su ortólogo en Xenopus (xlAZIN2) es degradado por AZ1 y presenta actividad descarboxilasa de ornitina y lisina, con una afinidad superior por lisina que por ornitina. El análisis comparativo de xlAZIN2 con mODC y mAZIN2 mostró una mayor semejanza con mODC, basándose en su localización subcelular citosólica y en la capacidad de ambas proteínas para formar oligómeros. Además, al igual que mODC, xlAZIN2 presenta una vida media muy corta (inferior a 30 minutos) y estimula la captación de agmatina en detrimento de la de putrescina y espermidina.
5. Estudio de Gm853, un nuevo parálogo de Odc y Azin2 en ratón.
El análisis comparativo de la secuencia proteica de los distintos parálogos de ODC reveló la existencia de GM853, una nueva proteína homóloga de ODC y AZINs en ratón, que conserva todos los residuos relacionados con la actividad catalítica. Estudios con células transfectadas demostraron que GM853 no es un inhibidor de antizimas, ya que no evita la interacción entre ODC y AZ1. En cambio, es una proteína estable localizada fundamentalmente en el citosol y es capaz de formar homodímeros y homotetrámeros pero no heterodímeros con otros parálogos. GM853 presenta actividad enzimática, siendo la primera proteína descrita en mamíferos con actividad descarboxilasa de leucina. En ratón, GM853 se encuentra en el riñón y su expresión depende de los niveles de testosterona, predominando en el riñón de ratones machos. El producto de la descarboxilación de la leucina es la isopentilamina, una amina que es rápidamente eliminada a través de la orina.
