Resumen de Estudio del perfil transcripcional de los receptores nucleares lxr en un modelo celular de macrófago murino inmortalizado
- español
LXR alfa y LXR beta son factores de transcripción que pertenecen a la familia de los receptores nucleares. Son activados por formas modificadas de colesterol (oxisteroles), controlando la transcripción de genes que juegan un papel crucial en el metabolismo lipídico. También intervienen en diversos aspectos de la biología del macrófago: respuesta inflamatoria, supervivencia ante agentes infecciosos y fagocitosis de restos celulares. Comparten un alto porcentaje de homología de secuencia y se conocen algunas funciones desempeñadas indistintamente por ambos, pero el papel individual de cada uno de los receptores LXR no ha sido aún caracterizado en profundidad.
Uno de los objetivos que se ha abordado en la presente Tesis Doctoral ha sido identificar las funciones biológicas comunes y diferenciales en las que intervienen los receptores LXR en macrófagos murinos. Hemos diseñado un modelo celular de expresión de los receptores LXR alfa y LXR beta de forma individualizada, así como un modelo control, carente de expresión de receptores LXR. Se realizó un estudio de expresión génica derivada de la actividad de LXR alfa y LXR beta, en presencia de un agonista y antagonista sintéticos, mediante la técnica de microarrays de ADN. Adicionalmente, se empleó esta técnica para realizar un análisis comparativo de expresión génica entre los modelos de macrófago generados. Con la aplicación de herramientas bioinformáticas se ha caracterizado la identidad y número de genes que se expresaron con una magnitud significativa, así como las funciones biológicas en las que están implicados. Estas herramientas también han posibilitado esclarecer los posibles mecanismos transcripcionales por los que las proteínas LXR ejercerían un control sobre los genes diana, como pueden ser la inducción o represión transcripcionales.
Encontramos que la actividad transcripcional dependiente de ligandos sintéticos es similar entre los dos receptores LXR alfa y LXR beta y que, a pesar de su elevado grado de homología de secuencia, comparten el control de la expresión génica de una fracción proporcionalmente pequeña de genes. La expresión de LXR beta en el macrófago participa en el control transcripcional preferencial de un grupo de genes relevantes por su implicación en diferentes aspectos de la respuesta inflamatoria. Por otro lado, el receptor nuclear LXR alfa presenta una actividad transcripcional dual: es responsable tanto del aumento como de la represión de numerosos grupos de genes que desempeñan funciones muy variadas.
Otro objetivo consistió en profundizar en el conocimiento de la organización genómica del macrófago murino y la interacción de los receptores LXR con las secuencias reguladoras conocidas y de potenciales nuevos genes diana. Se optimizó la técnica de inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación masiva (ChIP seq) para su aplicación en el genoma de macrófagos murinos, lográndose identificar los sitios de unión de las proteínas LXR alfa y LXR beta a nivel de genoma completo (cistroma). También se han estudiado con esta técnica los cambios genómicos en las marcas de acetilación en la lisina 27 de la histona H3, asociada con una transcripción activa de genes, en presencia de un agonista y antagonista sintéticos de LXR.
Finalmente, se examinó la funcionalidad de regiones reguladoras de la transcripción de genes diana conocidos de LXR con técnicas avanzadas de edición génica (CRISPR). Se alteró la secuencia consenso de unión de las proteínas LXR en la región reguladora de la transcripción del gen Mylip, revirtiendo la activación transcripcional en este gen por LXR en presencia de su agonista sintético.
Tanto el modelo celular que hemos generado como las técnicas de nueva generación aplicadas al estudio del genoma: ChIP seq y CRISPR, han demostrado su gran potencial como herramientas experimentales para el estudio de la actividad de los receptores nucleares LXR y su interacción con el genoma de macrófago murino.
- English
The LXR proteins, LXRα and LXRβ, are transcription factors that belong to the nuclearreceptor superfamily. They are activated by modified forms of cholesterol (oxysterols) andcontrol the transcription of genes that play a crucial role in the regulation of lipid metabolism.They also mediate several aspects of macrophage biology like the inflammatory response, cellsurvival in response to infection and phagocytosis of cell debris. These proteins share a highsequence homology and even some functions are known to be performed equally by LXRα andLXRβ, but the individual biological role of each LXR nuclear receptor has not been characterizedto date.One of the objectives that we have pursued in the present thesis project has been toidentify both the common and differential biological functions in which the LXR nuclearreceptors take part in mouse macrophages. We have developed a cellular model of expression toisolate transcriptional activities of LXRα and LXRβ, in addition to a control model that does notexpress LXR proteins. We performed a gene expression analysis of LXRα and LXRβ, in thepresence of a synthetic agonist and antagonist, using microarray technology. Additionally, wemade use of this technique to carry out a comparative analysis of gene expression among thedifferent macrophage cell lines. Using bioinformatics tools we analysed the number andidentities of the gene transcripts that were expressed significantly higher and the biologicalpathways in which they were involved. These bioinformatics tools have also been useful inclarifying possible mechanisms underlying LXR transcriptional gene control, like expressioninduction or repression.Here we show that ligand‐dependent transcriptional activity is similar for both LXRα andLXRβ nuclear receptors and that, despite their high sequence homology, they share the controlof a proportionally reduced fraction of genes. Stable expression of LXRβ in macrophages is linkedto preferential transcription of a relevant group of genes for their implication in different aspectsof inflammatory response. On the other hand, LXRα displays a dual transcriptional activity: it isresponsible for both transcriptional expression and repression of large group of genes involvedin several different biological activities...
