Resumen de Influencia del factor femenino y masculino en el cultivo a blastocisto y sus complicaciones clínicas
Introducción El ovocito humano se fecunda en las trompas de Falopio y se va desarrollando durante su transporte hacia el útero, donde se implantará en estadio de blastocisto. El estadio de blastocisto es la fase del embrión por sí solo más evolucionada, reconociéndose como la fase previa a la implantación en el endometrio materno. Tanto el genoma del ovocito como del espermatozoide participan por igual en la creación del genoma embrionario, aunque éste no será activo hasta el día +3 de desarrollo.
En el blastocisto se puede observar un mayor grado de diferenciación celular, distinguiéndose dos poblaciones de células: las células del trofoectodermo (TE), aquellas que forman la propia estructura del embrión y, las células de la masa celular interna (MCI), situadas dentro del blastocele.
El cultivo de blastocistos o cultivo largo puede considerarse como parte de la selección natural que sufren los embriones durante su desarrollo los cinco o seis primeros días, siendo aquellos que llegan a dicho estadio, los que tienen mayores probabilidades de implantación y embarazo tras la transferencia. Este hecho es debido al mayor grado de diferenciación celular y, al hecho de que el genoma embrionario comience a funcionar a partir de día +3. Por tanto, las principales ventajas del cultivo y transferencia de blastocistos implican: la sincronización del embrión con el tracto femenino y la evaluación de la viabilidad del embrión propiamente dicho antes de la transferencia. Por el contrario, la mayor preocupación del cultivo largo radica en las diferencias entre las condiciones in vitro e in vivo que pueden producir que algunos embriones viables puedan detener su desarrollo debido a imperfecciones del sistema in vitro. No existe un consenso claro para decidir transferir los embriones en día +3 o llevarlos a cultivo largo y transferirlos en día +5, aunque hay una tendencia lógica a dejarlos a cultivo largo cuando hay un mayor número de embriones en día +3. Habitualmente, lo común había sido transferir en día +2 o +3 de desarrollo. Sin embargo, los grupos que tuvieron la logística necesaria para cultivar los embriones hasta día +4 o +5, observaron tasas de gestación clínica y evolutiva hasta dos veces superiores que las conseguidas con embriones en día +2 o +3.
Desde los inicios de la FIV en humanos, la morfología embrionaria ha sido el principal método utilizado por los embriólogos para evaluar el desarrollo y seleccionar el mejor/es embrión/es para transferir o criopreservar. Aunque, cabe destacar que, la observación de la morfología embrionaria hasta día +3 de desarrollo se basa más en la propia morfología del ovocito que en la verdadera fisiología del embrión. El verdadero determinante del potencial de un embrión son los gametos de los que se deriva. Hay un porcentaje significativo de gametos que son cromosómicamente anormales, en el caso de las mujeres aproximadamente el 25% de los ovocitos de un TRA son aneuploides y la frecuencia de esta anomalía, aumenta con la edad materna. En el caso de los hombres, no todos los espermatozoides son cromosómicamente competentes. Por estas razones, un porcentaje significativo de embriones concebidos mediante ICSI no alcanzarán la etapa de blastocisto, es decir, no van a estar destinados a formar un embrión viable, sino que serán eliminados naturalmente y no llegaran a transferirse. Estos embriones, son aquellos que estaban gravemente anormales desde un punto de vista genético o que no fueron capaces de activar su genoma embrionario. Sin embargo, esto no garantiza que todos los embriones que llegan blastocisto sean genéticamente normales.
Después de la fecundación, el ooplasma se convierte en el citoplasma del embrión, mientras que la participación del espermatozoide hasta el comienzo de la activación del genoma embrionario es mínima. Por esta razón, la calidad de los ovocitos es un factor clave para determinar la calidad de los primeros pasos del desarrollo embrionario.
La edad femenina en sí misma es uno de los factores predictivos más relevantes para la consecución del embarazo. Existe una disminución natural de la fertilidad femenina con el aumento de la edad materna y, el punto de inflexión parece estar en los 35 años. Una posible explicación a este fenómeno reside en la disminución de la reserva ovárica o el envejecimiento de los ovocitos. Las opciones para tratar la infertilidad relacionada con la edad incluyen la hiperestimulación ovárica controlada y la donación de ovocitos, sobre todo para las mujeres mayores de 40 años o aquellas con una reserva ovárica disminuida.
De manera tradicional, la infertilidad masculina se ha evaluado con un en análisis de semen de rutina, en el que se incluye el estudio de la concentración, motilidad y morfología espermática. Sin embargo, los criterios establecidos para la normalidad de dichos parámetros seminales, ofrecen un valor pronóstico limitado en la predicción de los resultados de un TRA. Por esta razón, últimamente, el índice de fragmentación del ADN espermático (IFE) también ha ganado un gran valor diagnóstico.
Según algunos estudios, la capacidad de la técnica de ICSI para esquivar calidades seminales alteradas hace que, la tasa de fecundación, la división del embrión y la consecución del embarazo sean independientes de los parámetros seminales. Esto es debido a que se consigue seleccionar el espermatozoide con mejor aspecto morfológico y motilidad de los que hay disponibles, sea cual sea la calidad seminal. Aunque, hay que tener en cuenta que, actualmente hay evidencias de que los espermatozoides con el ADN fragmentado pueden estar vivos, ser morfológicamente normales y capaces de fecundar al ovocito.
Por tanto, el daño en el ADN espermático es una causa de infertilidad importante y tiene un gran valor diagnóstico y pronóstico en comparación con otros parámetros seminales de rutina.
Varios autores han reportado una correlación negativa entre el IFE alterado y los resultados en los TRA, observándose una disminución de los mismos. Aunque la verdadera importancia clínica del daño en el ADN espermático aún no se ha establecido por completo ya que los estudios disponibles son muy heterogéneos.
Ahora bien, hay evidencia de que el ovocito es capaz de reparar en cierta medida el daño en el ADN del espermatozoide, aunque esta reparación está asociada con el tipo de daño y con la calidad del ovocito. Por consiguiente, en los ovocitos y embriones, la reparación del ADN espermático es probablemente uno de los procesos más importantes que se deben realizar tras la fecundación, para permitir un desarrollo embrionario completo.
Hipótesis El objetivo general del presente trabajo fue estudiar cómo influyó el factor femenino y masculino en el en el desarrollo embrionario hasta blastocisto y cómo de determinantes fueron en la consecución del embarazo. Teniendo en cuenta que, el cultivo largo nos proporciona por un lado, una información adicional que mejora la selección de los embriones a transferir aumentando así, la tasa de gestación evolutiva y, por otro lado, transferir blastocistos consigue una mejor sincronía endometrial, en el presente trabajo también se profundizó en los mecanismos implicados en dichos efectos.
Objetivos Para ello, mediante un estudio prospectivo no randomizado y, utilizado ciclos de ICSI con cultivo largo, se plantearon los siguientes objetivos: 1. Evaluar el factor ovocitario y ver cómo influye la edad materna en el desarrollo de los embriones desde día +1 hasta día +5 o +6, así como, en la consecución del embarazo.
2. Evaluar el factor masculino y ver cómo se relaciona la calidad seminal en el desarrollo de los embriones desde día +1 hasta día +5 o +6, así como, en la consecución del embarazo.
3. Estudiar y analizar el efecto de la fragmentación del ADN espermático (IFE) en el desarrollo del embrión y la capacidad del ovocito para reparar dicho daño espermático.
4. Evaluar si las calidades embrionarias propuestas en día +3 de desarrollo pueden pronosticar las calidades en día +5.
5. Evaluar qué tipo de pacientes se ven beneficiados al realizar cultivo largo.
Materiales y métodos Se seleccionaron de forma prospectiva y no randomizada todos los ciclos de cultivo largo realizados en GINEFIV, durante el periodo comprendido entre Enero de 2012 y Septiembre de 2015. El resultado de dicha selección fue 662 pacientes que llevaron sus embriones a día +5 o +6 de desarrollo generando 2898 embriones en estado de blastocisto que, o bien se transfirieron ese mismo ciclo, o bien se vitrificaron para futuros tratamientos.
Se incluyeron tanto los ciclos con ovocitos propios y donados, como los ciclos con semen homólogo y heterólogo. Las pacientes con ovocitos propios, además de haber sido sometidas a una estimulación ovárica controlada, también se sometieron a una preparación endometrial mediante la administración de gonadotropinas. Las receptoras de ovocitos únicamente se sometieron a la preparación endometrial.
Todas las muestras seminales fueron obtenidas por masturbación el mismo día de la punción o días previos. Si la muestra se obtuvo días previos, se congeló hasta el día de su utilización. Se realizó un seminograma previo para realizar un diagnóstico de las muestras siguiendo los valores de referencia establecidos por el manual de la OMS de 2010. Todas las muestras se capacitaron y, tras la capacitación, se realizó el swim-up para recuperar solo aquellos espermatozoides con mejor motilidad.
El análisis del IFE se realizó por citometría de flujo, técnica que mide el porcentaje de espermatozoides con roturas en la cadena de ADN mediante su desnaturalización inducida por un pH bajo. Se expresa como índice de fragmentación del ADN espermático (IFE) y es una medida precisa y repetible. Se consideró una muestra alterada cuando el IFE fue igual o superior al 27%.
Los cúmulos obtenidos en la punción ovárica se mantuvieron hasta el proceso de decumulación en medio de cultivo G-IVFTM PLUS (VITROLIFE) cubierto con aceite de parafina filtrado (OVOILTM, VITROLIFE). Previamente a la ICSI, se realizó la decumulación de los cúmulos usando hialuronidasa (HYASETM-10X, VITROLIFE) y medio tamponado (G-MOPSTM PLUS, VITROLIFE) en una relación 1:9. Únicamente los óvulos en estadio de metafase II (MII) fueron destinados al proceso de microinyección.
El proceso de microinyección se realizó con la ayuda de micropipetas HUMAGEN™ (Fertility Diagnostics) a 37ºC. Los óvulos microinyectados se cultivaron de forma individualizada en microgotas de G-1TM v5 PLUS (VITROLIFE) cubiertos con aceite OVOILTM (VITROLIFE) y, se mantuvieron en cultivo en las estufas incubadoras con trigas.
La división de los zigotos se evaluó siguiendo las pautas de la Asociación para el Estudio de la Biología de la Reproducción (ASEBIR). En el estudio se recogieron los datos de las cuatro calidades en día +3 y +5 de desarrollo, además del tipo de blastocisto que llegaron a formar y posteriormente transferir. La transferencia intrauterina ecoguiada se realizó en día +5 de desarrollo mediante sondas Gynétics (GYNÉTICS MEDICAL PRODUCTS) o Labotect (LABOTECT), según la facilidad de acceso al útero.
A los 14 días tras la transferencia embrionaria, la detección en sangre de la gonadotropina coriónica humana (β-HCG) mostró la presencia de gestación positiva. Las pacientes fueron citadas para controles ecográficos y se recogió la presencia de saco gestacional (SG) y latido cardíaco fetal (LCF). Posteriormente, se mantuvo un registro de las gestaciones evolutivas que llegaron a término.
El análisis estadístico se realizó mediante el programa informático SPSS 23.0. La significación estadística se determinó como p<0,05. Se analizaron las diferencias estadísticamente significativas en las variables para la comparación de medias y proporciones. Además, se realizaron modelos de regresión logística binaria para ver qué variables fueron las que influyeron significativamente en la tasa de llegada a blastocisto y la tasa de gestación clínica y, modelos de curvas ROC (receiver operating characteristic curve) para las calidades embrionarias en día +3 y +5. Dentro de este análisis, se combinaron también distintas variables (datos no mostrados) hasta dar con una combinación con un valor predictivo significativo. Todos los resultados fueron calculados por transferencia realizada y siguiendo la recomendación de Zegers-Hochschild y colaboradores 2009.
Resultados Cuando se compararon estadísticamente las medias y proporciones de las variables analizadas, el grupo de pacientes que usaron sus propios ovocitos se dividió en cinco subgrupos atendiendo a la edad materna y se compararon en función de la calidad seminal.
De tal manera que cuando se usó donante de semen, se observó que la tasa de fecundación fue significativamente mayor en el grupo de edad materna de 40-45 años. Sin embargo, la tasa de llegada a blastocisto fue significativamente menor a partir de 30-35 años y la tasa de gestación evolutiva disminuyó estadísticamente a partir de los 40 años.
Cuando la calidad seminal fue normozoospérmica, la tasa de llegada a blastocisto fue significativamente menor a partir de los 40 años. No obstante, la tasa de gestación clínica y evolutiva fue significativamente mayor en las pacientes mayores de 40 años que en las pacientes entre 35-40 años.
Cuando la calidad fue no normozoospérmica, no se observaron diferencias significativas en la tasa de llegada a blastocisto aunque la tasa de gestación clínica y evolutiva fue significativamente mayor en el grupo de pacientes menores de 30 años.
Cuando la calidad seminal tuvo como parámetro común alterado la teratozoospérmia, la tasa de llegada a blastocisto fue significativamente menor a partir de los 40 años. Mientras que, la tasa de gestación clínica y evolutiva fue significativamente mayor en las pacientes menores de 30 años.
Por último, cuando la calidad seminal tuvo todos los parámetros alterados a la vez (oligo-terato-asteno-necrozoospermia (OTAN)), la tasa de llegada a blastocisto y la de gestación clínica y evolutiva fueron estadísticamente menores a partir de los 35 años.
Sin embargo, cuando la comparación de medias y proporciones se realizó en las receptoras de ovocitos, no se observaron diferencias significativas en ninguna de las variables estudiadas en función de las calidades seminales.
Cuando se tuvo en cuenta el IFE, se observó que hubo significativamente un mayor número de muestras normozoospérmicas con un IFE normal. En contraste, hubo significativamente más muestras con la morfología alterada y OTAN con un IFE alterado.
Cuando se estudió la influencia del IFE en las pacientes con ovocitos propios, se analizó por un lado el factor etario utilizando muestras con IFE normal o alterado. En este análisis no se encontraron diferencias significativas entre ser mayor o menor de 35 años. Por otro lado, se analizaron también las diferencias significativas entre tener un IFE normal o alterado en pacientes menores de 35 años y mayores de 35 años. En este caso se observaron diferencias significativas a favor de las muestras con un IFE alterado en el número de embriones en día +3 en pacientes mayores de 35 años y en la tasa de gestación clínica en pacientes menores de 35 años.
Sin embargo, cuando las pacientes fueron receptoras de ovocitos y se quiso analizar la influencia del IFE, se observaron diferencias significativas en la tasa de gestación clínica, siendo ésta mayor cuando el IFE fue normal.
En un segundo análisis estadístico se realizaron modelos de regresión logística binaria para dos variables dependientes: la llegada a blastocisto de al menos el 60% de los embriones y la consecución de la gestación clínica, ambas en función de variables predictivas.
Cuando la variable predictiva fue el origen de los ovocitos, se observó que las receptoras de ovocitos tuvieron un valor predictivo significativo a favor de ambas variables dependientes. Las pacientes menores de 30 años que usaron sus ovocitos también mostraron un valor predictivo significativo a favor de las variables dependientes.
Por el contrario, cuando la calidad seminal actúo como variable predictiva, únicamente se observó que las muestras normozoospérmicas, en el grupo de pacientes con ovocitos propios menores de 35 años, tuvieron un valor predictivo significativo que pronosticó la llegada a blastocisto de al menos el 60% de los embriones.
Cuando las variables predictivas fueron las calidades embrionarias propuestas en día +3 y +5, se observó que en las receptoras de ovocitos y en las pacientes con ovocitos propios mayores de 35 años, las calidades propuestas en día +5 tuvieron un mayor valor predictivo que las calidades en día +3 para ambas variables dependientes. Sin embargo, en las pacientes con ovocitos propios menores de 35 años, las calidades propuestas en +3, concretamente la calidad C, tuvo mayor valor predictivo que las calidades propuestas en día +5 en la consecución de la gestación clínica.
Por último, cuando las pacientes con ovocitos propios mayores de 35 años fueron capaces de formar blastocitos de tipo expandido y eclosión, tuvieron un valor predictivo significativo a favor de la consecución de la gestación clínica.
Conclusiones En nuestro estudio, donde se valoró la influencia del factor femenino y masculino en la llegada al estadio de blastocisto y la consecución del embarazo, presentamos las siguientes conclusiones: 1. Según nuestros datos, el origen de los ovocitos (donados o propios) tuvo mayor valor predictivo que la calidad seminal cuando se realizó una ICSI.
2. Los pacientes con ovocitos propios mayores de 35 años y las receptoras de ovocitos, se beneficiaron del cultivo largo. Para ambos grupos de pacientes las calidades embrionarias propuestas en día +5 tuvieron mayor valor predictivo que las calidades en día +3.
3. Sin embargo, en las pacientes con ovocitos propios menores de 35 años, el cultivo largo no les confirió un beneficio adicional al que ya tiene de por sí: tener mayor información para realizar una selección embrionaria más acertada que en día +3.
4. Los datos analizados no permiten recomendar el IFE como una prueba de rutina añadida en todos los pacientes, ya que los métodos de capacitación y la técnica ICSI, tienden a reducir el número de espermatozoides con IFE alterado. Además, el hecho de no haber encontrado diferencias significativas en la tasa de llegada a blastocisto pero sí en la de gestación clínica en los pacientes con un IFE alterado, nos lleva a suponer que el efecto de la fragmentación espermática se manifieste más allá del estadio de blastocisto. Por tanto, estos pacientes no se verán más beneficiados del cultivo largo que otros pacientes con un IFE normal.
