New therapeutic properties for the jewel of Andalusia: evaluation of the anti-inflammatory activity of olive leaf extract (Olea europaea L.) in experimental models of intestinal inflammation and metabolic syndrome
- Autores: Teresa Vezza
- Directores de la Tesis: Pilar Utrilla Navarro (dir. tes.), Julio Juan Gálvez Peralta (dir. tes.), Giovanni Monteleone (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2017
- Idioma: inglés
- ISBN: 9788491636175
- Número de páginas: 210
- Tribunal Calificador de la Tesis: Severiano Risco Acedo (presid.), Manuel Gómez Guzmán (secret.), Ivan Monteleone (voc.), Juana Benedí González (voc.), María José Montero Gómez (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Medicina Clínica y Salud Pública por la Universidad de Granada
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
La Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) y el Síndrome Metabólico (SM) constituyen dos enfermedades cuya prevalencia e incidencia se encuentran en continuo incremento, especialmente en países desarrollados.
La Enfermedad Inflamatoria Intestinal comprende la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU). Ambas se caracterizan por una inflamación crónica del intestino derivada de una respuesta inmune intestinal exacerbada ante un determinante antigénico desconocido, en la que se alternan periodos de exacerbación de los síntomas, seguidos de intervalos más o menos prolongados de remisión de los mismos [1, 2]. Aunque hasta el momento se desconocen los mecanismos responsables de la iniciación y perpetuación en el tiempo del proceso inflamatorio intestinal, se acepta que están implicados factores genéticos, ambientales e inmunológicos. Así, numerosos estudios han propuesto que, en personas genéticamente predispuestas, una activación exagerada y descontrolada del sistema inmune intestinal frente a un determinante antigénico desconocido, puede desencadenar la aparición de la respuesta inflamatoria intestinal exacerbada [3]. Esta respuesta inmunológica genera numerosos mediadores de carácter pro-inflamatorio (citocinas, eicosanoides y metabolitos reactivos derivados del oxígeno o del nitrógeno) que actúan de forma sinérgica y simultánea promoviendo la amplificación y cronificación del proceso inflamatorio intestinal [4-6].
El sindrome metabolico (SM) es el conjunto de alteraciones metabólicas constituido por la existencia de obesidad de distribución central, conjuntamente con otras alteraciones que pueden incluir la disminución de las concentraciones del colesterol unido a las lipoproteínas de alta densidad, la elevación de las concentraciones de triglicéridos, el aumento de la presión arterial y la hiperglucemia asociada a resistencia a la insulina [7]. La obesidad, considerada como eje central en el desarrollo del síndrome metabólico, es una enfermedad crónica, de etiología compleja y multifactorial, y que se desarrolla por un desequilibrio entre la energía ingerida y la energía gastada, es decir, una acumulación anormal o excesiva de energía en forma de grasa en el tejido adiposo. El exceso de energía se almacena en los adipocitos, los cuales aumentan en tamaño y/o en número. Este desequilibrio es el resultado de la combinación de varios factores fisiológicos, psicológicos, metabólicos, genéticos, socioeconómicos y culturales. En los últimos años se ha observado que los pacientes obesos presentan un estado inflamatorio crónico subclínico como consecuencia del incremento en la masa del tejido adiposo, que lleva a un aumento en la producción de mediadores proinflamatorios que son conjuntamente estimulados por señales de origen exógeno y/o endógeno. El tejido adiposo contiene fibroblastos, preadipocitos, adipocitos y macrófagos; estos últimos contribuyen de manera importante al proceso inflamatorio sistémico con la producción de mediadores proinflamatorios. Así, existe una asociación íntima, altamente coordinada, entre las vías inflamatorias y las metabólicas [8]. Además, recientemente se ha prestado atención al vínculo entre la composición de la microbiota intestinal, la permeabilidad intestinal y la obesidad. Así, se ha observado, en modelos animales y en humanos, que la microbiota intestinal es una fuente de endotoxinas (LPS) cuya presencia en el plasma está relacionada con la obesidad y la resistencia a la insulina, a través del aumento de la permeabilidad intestinal. El correcto funcionamiento de la barrera intestinal es esencial para evitar la excesiva translocación de estas moléculas tóxicas a la circulación y la microbiota puede influir en la integridad del epitelio intestinal y la inflamación de la mucosa, ambas involucradas en la permeabilidad intestinal.
Actualmente no existe un fármaco ideal que combine efectividad con ausencia de reacciones adversas en el tratamiento de estas dos enfermedades, por lo que se hace necesaria la investigación de nuevas estrategias terapéuticas que aúnen eficacia y seguridad. Además, distintos estudios han puesto de manifiesto la tendencia actual por parte de los pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal y/o alteraciones metabólicas de emplear medicinas alternativas y/o complementarias en el tratamiento de sus enfermedades, probablemente como consecuencia de la falta de eficacia que el tratamiento convencional tiene en muchas ocasiones, o derivados de la elevada incidencia de reacciones adversas que les caracteriza [9, 10]. Entre la distintas terapias alternativas utilizadas destaca el empleo de plantas medicinales con propiedades antiinflamatorias: son tratamientos seguros, con empleo ancestral y escasa aparición de efectos secundarios, y que contienen una mezcla de principios activos que pueden asegurar la actuación simultanea sobre distintas dianas terapéuticas afectadas durante el proceso inflamatorio. En ocasiones, el empleo empírico de plantas medicinales antiinflamatorias o útiles en patologías intestinales, no tiene una constatación científica avalada. Este podría ser el caso del uso de extractos vegetales procedentes de plantas medicinales de Andalucía utilizadas tradicionalmente por sus propiedades antiinflamatorias y en problemas digestivos.
El olivo (Olea europea L.) es una especie muy abundante en Andalucía de la cual se hace un aprovechamiento industrial, alimentario y medicinal. Entre los usos tradicionales de la hoja de olivo se encuentra el antihipertensor y el antidiabético, lo cual justifica la inclusión en este estudio.
OBJETIVO El presente trabajo de Tesis doctoral pretende valorar el potencial efecto antiinflamatorio de un extracto bien caracterizado desde el punto de vista químico de hojas de olivo, en modelos de colitis experimental o de síndrome metabólico. La presencia de diferentes componentes activos polifenólicos en este tipo de extracto vegetal hace que pueda ser candidato para su potencial uso en pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal y en personas obesas.
Así, se propusieron tres objetivos principales: 1. Evaluar la actividad inmunomoduladora de las hojas de olivo: a) in vitro a través de estudios en macrófagos murinos, células epiteliales murinas y humanas, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) procedentes de individuos sanos y pacientes con Enfermedad de Crohn.
b) ex-vivo, utilizando explantes humanos provenientes de pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal.
2. Evaluar el efecto anti-inflamatorio intestinal de distintas dosis de extracto de hoja de olivo en modelos de colitis experimental inducida por ácido dinitrobencenosulfónico (DNBS) y en el modelo del sulfato de dextrano sódico (DSS) en ratones.
3. Evaluar el efecto de las hojas de olivo en un modelo experimental de obesidad en ratones con especial atención a la disfunción vascular.
En todos estos ensayos se pretendió recabar información que permitiera establecer los mecanismos responsables de los posibles efectos beneficiosos.
METODOLOGÍA El extracto objeto de nuestro estudio fue proporcionado por CIDAF, y caracterizado químicamente [11]. Todos los protocolos que implican experimentación animal fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Granada (Ref. No. CEEA-2010-286 ; Ref. No. 94-CEEA-OH 2015).
1. Evaluación “in vitro” de la actividad inmunomoduladora del extracto de hojas de olivo.
1.1. Ensayos “in vitro” en células.
Para ello, se valoró el efecto que distintas concentraciones del extracto de hojas de olivo tienen sobre la viabilidad y actividad de varios tipos celulares involucrados en la respuesta inmune intestinal: macrófagos murinos (RAW 264), células epiteliales murinas (CMT-93) y humanas (Caco-2), y en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) procedentes de individuos sanos y pacientes con Enfermedad de Crohn.
Todas las células se cultivaron hasta la formación de una monocapa, se preincubaron con diferentes concentraciones de extracto de hoja de olivo que oscilaron entre 0,1 y 100 μg/ml durante 2 horas y se estimularon con el lipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli (100 ng/ml) o interleucina (IL) -1β (1 ng/ml) durante 24 horas. Las células no estimuladas y no tratadas, así como las células estimuladas con LPS o IL-1β pero no incubadas con extracto, se usaron como controles negativos y positivos, respectivamente. Después del período de estimulación, se recogieron los sobrenadantes y se midió la producción de citocinas mediante ELISA usando kits comerciales.
1.2. Estudio “ex-vivo” en explantes intestinales.
Se tomaron muestras quirúrgicas de pacientes con EC colónica sometidos a cirugía por enfermedad crónica activa, que respondían poco al tratamiento médico, o de pacientes con EC ileal sometidos a cirugía debido a estenosis. Las muestras se colocaron en rejillas de hierro con la cara mucosa hacia arriba en el pocillo central de una placa de cultivo de órganos y se incubaron a 37 ° C en presencia o ausencia de extracto de hoja de olivo (0.1-100 μg/mL) y / o LPS (100 ng/mL). Después de 24 h, las muestras de la mucosa se homogenizaron y se extrajo el ARN total. Paralelamente, se recogieron los sobrenadantes de cultivo y se evaluaron las citocinas factor de necrosis tumoral (TNF)-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 mediante ELISA.
2. Estudio de la actividad antiinflamatoria intestinal “in vivo”.
Los animales de experimentación que se utilizaron en estas experiencias fueron ratones CD1 y ratones C57BL/6J de 20 g de peso, suministrados por la Universidad de Granada y/o por Janvier, y que fueron alojados en el estabulario del Servicio de Animales de Experimentación de la Universidad de Granada. Se procedió a la valoración del efecto antiinflamatorio intestinal de las hojas de olivo en dos modelos de colitis experimental: colitis inducida por DNBS [12] y colitis inducida con DSS [13]. El tratamiento oral de los animales colíticos (n=10) con las distintas dosis del extracto se inició dos días antes de la inducción del daño colónico con el DNBS o el mismo día de la inducción en el caso del DSS. En el curso de la experiencia se determinaron una serie de parámetros generales como el seguimiento del consumo de comida, la evolución del peso corporal y la aparición de heces diarreicas, lo que permitió una asignación diaria del Índice de Actividad de la Enfermedad (IAE) [14]. Tras el sacrificio de los animales se obtuvieron los segmentos de colon, y se valoró el proceso inflamatorio intestinal mediante: a) Parámetros macroscópicos: existencia de adhesiones entre el colon y órganos adyacentes y la relación peso/longitud.
b) Estudio microscópico: para lo que se tomaron muestras del tejido inflamado de zonas representativas y se sometieron a técnicas estándar de microscopía óptica, que permiten valorar la alteración de la integridad intestinal a nivel microscópico (pérdida de la arquitectura de las criptas, infiltración de células inflamatorias), como consecuencia de la inducción de la colitis experimental [14] y el efecto beneficioso del tratamiento administrado.
c) Determinaciones bioquímicas: se procedió al análisis de la expresión génica y/o producción de marcadores del proceso inflamatorio. Esto incluye citocinas como TNF-α, IL-1ß, IL-6, IL-17; mediadores quimiotácticos como la proteína quimio-atrayente de monocitos MCP-1 (monocyte chemoatractant protein), la proteína inflamatoria de macrófagos MIP (macrophage inflammatory protein)-2; la molécula de adhesión intercelular ICAM (inter-cellular adhesion molecule)-1, y marcadores de la función de barrera intestinal como mucinas (MUC-2 y MUC-3), trefoil factor (TFF)-3, y proteínas de las uniones estrechas del epitelio como Zonula occludens (ZO)-1.
d) Valoración de la permeabilidad intestinal, mediante la administración oral de FITC-dextrano a los ratones sometidos a inflamación intestinal con DSS, y determinación a las cuatro horas de la concentración plasmática del mismo por espectrofluorometría.
3. Estudio del efecto de las hojas de olivo en un modelo de obesidad.
Se utilizaron ratones C57BL/6J de 5 semanas de edad que consumieron una dieta estándar o una dieta rica en grasa, en la que el 60% del aporte calórico provenía de grasa de origen animal. Los ratones se dividieron aleatoriamente en 6 grupos experimentales: grupo sano (dieta estándar), grupo control sano (administrado con la dosis mayor del extracto), grupo obeso (dieta rica en grasa) y 3 grupos obesos (dieta rica en grasa) tratados con distintas dosis del extracto de hojas de olivo. El tratamiento duró 5 semanas. Durante el periodo experimental se midió el peso corporal, el consumo de comida y bebida semanalmente [15]. Al final del tratamiento se tomaron muestras plasmáticas y tisulares (aorta, hígado, grasa epididimal e intestino). Un segmento de aorta se utilizó para estudios de la funcionalidad endotelial. Para la caracterización metabólica se midieron los niveles plasmáticos de glucosa, y colesterol (cHDL y cLDL), mientras que la insulina se calculó mediante enzimoinmunoensayo. El grado de resistencia a la insulina se evaluará con el cálculo del HOMA-IR. Muestras de tejido adiposo y de hígado se utilizaron para la extracción de ARN con el objeto de evaluar la expresión de diferentes biomarcadores que se ven alterados en condiciones de obesidad: marcadores de tipo inflamatorio (TNF-α, IL-1β, IL-6), proteínas implicadas en el mantenimiento de la homeostasis energética (leptina y adiponectina), receptores activados por proliferadores de peroxisomas (PPARα y PPARγ), la proteína trasportadora de membrana de glucosa (GLUT-4) y la proteína quinasa AMP (AMPK) involucrada en los procesos metabólicos. Las muestras de intestino grueso se utilizaron para la extracción de ARN con el objetivo de evaluar la expresión de diferentes biomarcadores relacionados con la función de barrera intestinal: MUC-2, MUC-3, ZO-1 y ocludina. Además, se recogieron los contenidos fecales para la extracción de ADN bacteriano genómico en su totalidad y se realizó la amplificación del gen 16S del ARNr. Posteriormente, se llevó a cabo la secuenciación del material genético por pirosecuenciacion de los amplicones [16].
RESULTADOS El extracto de hojas de olivo manifestó efecto anti-inflamatorio intestinal en los dos modelos estudiados de colitis experimental en ratones: modelo experimental inducido por DNBS y el inducido por DSS. Mediante los estudios histológicos se observó una recuperación del daño intestinal y, a través de los análisis bioquímicos, se puso de manifiesto una mejora de los diferentes marcadores del proceso inflamatorio, entre los cuales se encuentran la reducción de la expresión de distintas citocinas como TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-8 e IL-17, la quimocina MCP-1 y la molécula de adhesión ICAM-1, mejorando así la respuesta inmune alterada asociada a la inflamación del colon. Además, el extracto fue capaz de incrementar significativamente la expresión de marcadores de la integridad del epitelio intestinal como MUC-2 y TFF-3, poniendo de manifiesto una mejora de la permeabilidad del colon que se encuentra alterada en la inflamación intestinal, y que se corroboró por lo estudios funcionales llevados a cabo con el FITC-dextrano en el modelo del DSS.
El efecto inmunomodulador directo por parte del extracto se comprobó in vitro en varios tipos celulares involucrados en la respuesta inmune intestinal: macrófagos murinos (RAW 264), células epiteliales murinas (CMT-93) y humanas (Caco-2) y en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) procedentes de individuos sanos y pacientes con Enfermedad de Crohn. El extracto inhibió la producción de nitritos inducida por LPS en células RAW y redujo la producción de IL-8 inducida por IL-1β en células Caco-2 y la liberación de IL-6 inducida por LPS en células CMT-93. Además, las propiedades inmunomoduladoras del extracto fueron confirmadas ya que disminuyó la producción de citoquinas proinflamatorias en PBMC estimuladas con LPS.
En forma adicional, se realizaron estudios ex-vivo. El extracto de hoja de olivo redujo significativamente la expresión de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 en explantes de colon de pacientes con EC cuando se estimularon con LPS. Del mismo modo, la producción de estas citocinas se redujo significativamente por efecto del extracto. Sin embargo, no se pudo establecer una clara relación dosis-efecto, probablemente debido a la composición compleja del extracto. Por todo ello, podemos concluir que el extracto de hoja de olivo posee un efecto anti-inflamatorio en diferentes modelos de colitis experimental que podría ser atribuido a sus propiedades inmunomoduladoras.
Los efectos del extracto de hoja de olivo se pusieron de manifesto en un modelo de obesidad inducido por dieta rica en grasas (high fat diet –HFD-) en ratones. Después de 5 semanas, el peso corporal promedio de los ratones no tratados y alimentados con una dieta rica en grasa fue considerablemente mayor en comparación con los grupos de dieta standard. La administración del extracto a ratones obesos redujo significativamente este aumento de peso, aunque no se observaron diferencias significativas en el consumo de energía entre estos grupos, por lo que el efecto estaría relacionado con una disminución de la eficiencia energética. La administración del extracto redujo también la glucemia basal y la resistencia a la insulina, y mostró una mejoría en el perfil lipídico plasmático en comparación con los ratones obesos.
Además de las anomalías metabólicas, la obesidad está asociada con inflamación sistémica, que afecta tanto al hígado como al tejido adiposo [17]. Por consiguiente, en estos dos tejidos, los ratones alimentados con HFD mostraron una expresión aumentada de ARNm de las citocinas proinflamatorias TNF-α, IL-1β e IL-6. Además, en el tejido adiposo hubo una expresión incrementada del mediador quimiotáctico MCP-1 que facilitaría la infiltración y activación de macrófagos, y la posterior instauración del estado inflamatorio. Todos estos marcadores inflamatorios asociados a la obesidad se mejoraron significativamente en aquellos ratones alimentados con HFD tratados con el extracto, que mostraron principalmente una respuesta dosis dependiente. Además, las adipocinas secretadas por el tejido adiposo, la leptina y la adiponectina, muestran un papel clave en la integración del metabolismo sistémico, estando su producción y función alteradas en la obesidad [18]. En el presente estudio, la expresión tanto de leptina como de adiponectina en el tejido adiposo se vio afectada en ratones obesos cuando se comparó con los ratones alimentados con dieta standard, estando asociada a una expresión reducida del receptor de la leptina tanto en el hígado como en la grasa. La administración del extracto a ratones obesos dio como resultado una mejora significativa en la expresión de estas adipocinas en todas las dosis ensayadas. Además, la reducción de la expresión del receptor de leptina en el hígado y el tejido adiposo se mejoró significativamente con el extracto, aunque en el hígado, esto sólo se obtuvo con la dosis más alta analizada.
Por último, los estudios de expresión de marcadores en el intestino grueso indicaron que el extracto fue capaz de mejorar la función de barrera intestinal. En los ratones obesos esta función está alterada ya que se observa una reducción en la expresión colónica de ocludina y mucinas (MUC-2 y MUC-3). Sin embargo, en los ratones tratados los niveles son similares a los de los delgados.
Diferentes estudios han propuesto que la microbiota intestinal se puede considerar una diana para el tratamiento de diferentes afecciones inflamatorias, incluidas las localizadas en el sistema gastrointestinal, como la EII, y aquellas con manifestaciones sistémicas, incluyendo hipertensión y obesidad [19, 20]. Al considerar la obesidad, es bien sabido que se produce una alteración en la composición de la microbiota intestinal, que afecta principalmente a los dos principales grupos de bacterias beneficiosas dominantes en el intestino humano, los Bacteroidetes y los Firmicutes. Para evaluar la composición de la microbiota y su posible alteración en el modelo de obesidad y con los diferentes tratamientos realizamos la secuenciación del DNA extraído de las muestras fecales; y calculamos diferentes índices ecológicos como el de Shannon (parámetro que combina riqueza y uniformidad); Pielou (muestra la presencia eventual de algún individuo además de cómo se distribuye en la muestra) y por último el de Chao (índice de riqueza estimada). Además, se calculó la abundancia de los principales filos bacterianos y la ratio de los dos mayoritarios, Firmicutes y Bacteriodetes. La relación Firmicutes y Bacteriodetes, conocida como F/B, es un potencial marcador para evaluar una situación de disbiosis [21-23]. Los resultados revelaron que el tratamiento con el extracto en ratones obesos fue capaz de contrarrestar esta composición alterada de la microbiota intestinal, y la proporción de filo bacteriano principal se restauró a los valores normales observados en ratones alimentados con dieta estandard.
Además, las modificaciones significativas de las diferentes clases o géneros que pertenecen a los filos Actinobacteria, Bacteriodetes y Verrumicrobiota observadas en ratones obesos se restauraron parcialmente en aquellos ratones obesos tratados con el extracto de olivo. Especial atención se ha prestado al papel de Akkermansia muciniphila en la obesidad; se trata de una bacteria degradadora de mucina que reside en la capa de moco [24] y su abundancia se correlaciona inversamente con el peso corporal y la diabetes tipo 1 en ratones y humanos [25-28]. En el presente estudio, se observó una reducción en la proporción del género Akkermansia en ratones obesos control no tratados, y esto se revirtió después del tratamiento con el extracto. La restauración de la abundancia de Akkermansia sp. ejercida por el extracto de hojas de olivo podría estar asociada a la mejora en la función de barrera intestinal, a través del aumento de la producción de mucinas en el tejido colónico, ya que éstos son los principales nutrientes para estas bacterias. En consecuencia, la mejora en la disbiosis asociada a la obesidad en ratones obesos tratados con el extracto puede dar como resultado la modulación de la respuesta inmune alterada, contribuyendo así a los efectos beneficiosos observados en este modelo experimental de síndrome metabólico.
Distintos estudios han demostrado que la obesidad está asociada a alteraciones cardiovasculares, incluida la disfunción endotelial [15, 29]. De hecho la aorta de ratones obesos mostró respuestas vasodilatadoras a la acetilcolina dependientes del endotelio significativamente reducidas, lo que se considera un índice de la función endotelial, en comparación con las aortas del grupo control sano. El extracto de hojas de olivo revirtió la disfunción endotelial observada en los anillos aórticos de ratones obesos, en todas las dosis ensayadas.
CONCLUSIONES 1. El extracto de hojas de olivo manifestó un efecto anti-inflamatorio intestinal en dos modelos experimentales de colitis (DSS y DNBS). Son varios los mecanismos que pueden estar involucrados, como la capacidad de restaurar la integridad de la barrera intestinal y modular la producción de mediadores inflamatorios. Esta actividad se confirmó in vitro, donde el extracto redujo la expresión y/o producción de citoquinas proinflamatorias inducidas por estímulos inflamatorios en diferentes tipos de células inmunes, incluyendo células mononucleares de sangre periférica humana. Además, el extracto mostró un efecto directo en los explantes de la mucosa de los pacientes con EC, inhibiendo la producción excesiva de los mediadores proinflamatorios que caracteriza la enfermedad.
2. El extracto de hoja de olivo ejerció efectos beneficiosos en un modelo de obesidad inducido por dieta rica en grasas en ratones, con una mejora en el metabolismo alterado de glucosa y lípidos. Estos efectos se asociaron a la mejora en el estado inflamatorio sistémico, junto con la restauración de la disfunción vascular que caracteriza la obesidad. Diferentes mecanismos parecen participar, e incluyen propiedades prebióticas, que contrarrestan la disbiosis asociada a la obesidad y la mejora de la función de barrera epitelial intestinal. Además, los efectos moduladores de este extracto sobre la respuesta inmune alterada también pueden colaborar en los efectos beneficiosos contra la obesidad y las complicaciones derivadas.
