Función trófica de GDNF sobre neuronas catecolaminérgicas y descripción de su expresión en el cerebro de ratón

• Autores: María Hidalgo Figueroa
• Directores de la Tesis: Alberto Pascual Bravo (dir. tes.), José López Barneo (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2012
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Eduardo Soriano García (presid.), Pablo Mir Rivera (secret.), José A. Obeso Inchausti (voc.), Ignacio Torres Alemán (voc.), Juan José Toledo Aral (voc.)
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• Resumen

  • Función trófica del GDNF sobre neuronas catecolaminérgicas y descripción de su expresión en el cerebro de ratón Autora: María Hidalgo Figueroa Tutores: Alberto Pascual Bravo y José López Barneo Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) Universidad de Sevilla 21 de Marzo de 2012 El trabajo realizado en esta tesis doctoral se fundamenta en el estudio del factor neurotrófico derivado de la glía o GDNF. El estudio del GDNF cobró interés biomédico especial desde su descubrimiento en 1993, cuando tras su clonación e identificación se demostró que era capaz de inducir supervivencia de las neuronas dopaminérgicas en cultivo (Lin et al., 1993). A partir de estas observaciones, numerosos estudios han corroborado la acción protectora que ejerce el GDNF sobre algunas poblaciones neuronales, tanto en modelos animales con lesión inducida en la sustancia negra (SN) o locus coeruleus (LC) (Arenas et al., 1995; Tomac et al., 1995; Toledo-Aral et al., 2003) como en enfermos de Parkinson (Gill et al., 2003; Slevin et al., 2005), donde las neuronas catecolaminérgicas de la SN, área tegmental ventral (VTA) y LC se ven gravemente afectadas. Los resultados obtenidos con estas terapias no han sido claros debido a problemas con la administración de la proteína, así como por el poco conocimiento que se tiene sobre la biología y zonas de expresión de GDNF. Debido a que los ratones ¿knock-out¿ (KO) del GDNF (Moore et al, 1996; Pichel et al., 1996; Sánchez et al., 1996) o de alguno de sus receptores (Cacalano et al., 1998; Schuchardt et al., 1994) mueren el primer día de vida postnatal, nada se sabía de la función real del GDNF endógeno en el cerebro de ratones en estadios postnatales o adultos. Fue por ello que en nuestro laboratorio surgió el interés por estudiar GDNF, tanto su localización como su función biológica en el sistema nervioso central del ratón.

    Para poder estudiar la función de GDNF durante la vida adulta, en nuestro laboratorio se generó un ratón KO condicional, en el que se puede inducir la pérdida irreversible de una zona del locus gdnf (exón 3) mediante la inyección intraperitoneal de tamoxifeno (Hayashi et al., 2003). El tamoxifeno se administró en la vida adulta del ratón, para así poder estudiar la función y relevancia de GDNF en el cerebro ya desarrollado. 7 meses después de inducir la depleción del GDNF en estos ratones, se 2 observó un 60-70% de descenso en el número de neuronas dopaminérgicas de la SN y VTA, respectivamente, y una pérdida casi completa de las neuronas noradrenérgicas del LC. Un mes después de la depleción del GDNF no se detectaron cambios significativos en el número de neuronas catecolaminérgicas, indicando que la muerte neuronal producida por la falta de GDNF en estos núcleos no es inmediata, si no progresiva.

    Además, la muerte neuronal es específica de algunas regiones, ya que otros núcleos analizados como el núcleo arqueado, corteza o hipocampo no se vieron afectados por la falta de GDNF. Las zonas con alta expresión de GDNF, como son estriado, septum y tálamo, son dianas de proyección de neuronas procedentes de la SN, VTA y LC, lo cual explica que fueran concretamente sus neuronas las afectadas por la falta de GDNF. En paralelo con la muerte neuronal progresiva descrita, los animales con déficit de GDNF mostraron alteraciones motoras que se analizaron mediante pruebas de ¿campo abierto¿.

    Los animales KO condicionales desarrollaron hipoquinesia y un descenso en el número y duración de los movimientos verticales, afectaciones características de modelos animales de Parkinson (Meredith y Steiner 2006). Las alteraciones motoras observadas se agravaron de forma progresiva y comenzaron a ser significativas a partir de los 3 meses con déficit de GDNF.

    Estos resultados pusieron de manifiesto por vez primera que además de la función protectora que ejerce el GDNF exógeno frente al daño neuronal o en neuronas en cultivo, el GDNF endógeno del cerebro es imprescindible para la supervivencia de poblaciones específicas de neuronas en ratones adultos sanos. El ratón KO condicional del GDNF es un buen modelo animal para el estudio de las vías neuroprotectoras inducidas por el GDNF y por tanto para el estudio de las enfermedades neurodegenerativas, pudiendo facilitar el desarrollo de nuevas herramientas terapéuticas en las que se utilice el GDNF para evitar la neurodegeneración.

    El GDNF así como sus receptores se expresan en zonas específicas y no de forma ubicua en todo el cerebro, lo cual explica que su falta produzca afectación solo en algunas estructuras. Debido a que no existen anticuerpos que detecten el GDNF con la selectividad necesaria, para llevar a cabo nuestro trabajo sobre la expresión de GDNF utilizamos el modelo de ratón GDNF-LacZ (Sánchez et al. 1996), donde se expresa el gen codificante de la enzima ß-galactosidasa bajo el promotor endógeno del gdnf, de forma que se produce un precipitado azul en aquellos sitios donde se expresa GDNF.

    Estudiamos las zonas de expresión de GDNF durante el desarrollo postnatal y en ratones adultos. Este modelo animal, junto con otros, también se usó para identificar las 3 células que expresan GDNF en el estriado adulto de ratones sanos y parkinsonianos (tratados con MPTP). Comprobamos que el cerebro de ratones GDNF-LacZ neonatos poseen un patrón de expresión de GDNF diferente a los ratones adultos, destacando la ausencia en el núcleo estriado de ratones a día postnatal 0. Por lo tanto, aunque el GDNF es imprescindible en el estriado del ratón adulto, parece no tener el mismo papel funcional en el estriado del ratón neonato, ya que comienza su expresión en estadios postnatales más avanzados.

    Como se indicó anteriormente, para la identificación del tipo de células que expresan GDNF se utilizó el ratón GDNF-LacZ combinando en ellos la expresión de ßgalactosidasa con el marcaje por inmunohistoquímica de diferentes poblaciones celulares. Observamos que las células que expresan GDNF colocalizan con neuronas (NeuN positivas) y no con astrocitos (células GFAP positivas) ni microglía (células IBA1 positivas), es decir, son las neuronas y no la glía ni microglía las que expresan GDNF principalmente. Aproximadamente el 95% de las neuronas identificadas que expresan GDNF son interneuronas parvalbúmina positivas (PV+), mientras que tan solo ~5% son interneuronas acetil-colina-transferasa positivas y somatostatina positivas.

    Otras poblaciones de interneuronas estriatales como son las interneuronas calbindina positivas y calretinina positivas no parecen expresar GDNF. Tampoco se observó expresión de GDNF en las neuronas de proyección del estriado (DARPP-32+), aun siendo la población neuronal que recibe mayor inervación dopaminérgica y que representa el 90-95% de las neuronas estriatales (Tepper y Bolam, 2004). Estos datos se corroboraron utilizando el ratón GDNF-EGFP (Gong et al. 2003) que expresa EGFP bajo el promotor del gdnf.

    Existe controversia en la literatura en cuanto al tipo celular que expresa GDNF. Está descrito que la glía podría expresarlo en respuesta a daño neuronal, por lo que estudiamos la expresión de GDNF en animales GDNF-LacZ tratados con MPTP. Se comprobó que a pesar de que el tratamiento con MPTP induce una importante gliosis reactiva en el estriado, en ningún caso se observó un aumento de la expresión de GDNF por parte de la glía. Las poblaciones celulares que expresan GDNF tras el daño neuronal siguen siendo las mismas que en los ratones sanos.

    La identificación de las interneuronas PV+ como principal fuente de GDNF en el estriado da lugar a nuevas perspectivas en cuanto a la estimulación de la producción de GDNF, ya que la proteína puede ser liberada de forma no continua sino pulsátil, durante períodos de actividad de la red neuronal (Lonka-Nevalaita et al., 2010). Esto implicaría 4 que, puesto que las interneuronas PV+ están interconectadas entre ellas, en condiciones fisiológicas la liberación del GDNF es simultánea en todo el estriado, lo que optimiza su acción neurotrófica. Por ello, la estimulación de las interneuronas PV+ en enfermos de Parkinson podría generar un aumento en la producción y liberación del GDNF con los efectos terapéuticos que ello conllevaría. Sin duda, serán necesarios estudios posteriores para elucidar cómo se controla la secreción del GDNF en neuronas estriatales y cómo una hipotética inducción de su expresión podría contribuir en el mantenimiento de la vía nigroestriatal.

    BIBLIOGRAFÍA Arenas, E., M. Trupp, et al. (1995). "GDNF prevents degeneration and promotes the phenotype of brain noradrenergic neurons in vivo." Neuron 15(6): 1465-1473.

    Cacalano, G., I. Farinas, et al. (1998). "GFRalpha1 is an essential receptor component for GDNF in the developing nervous system and kidney." Neuron 21(1): 53-62.

    Gill, S. S., N. K. Patel, et al. (2003). "Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease." Nature medicine 9(5): 589-595.

    Gong, S., C. Zheng, et al. (2003). "A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes." Nature 425(6961): 917-925.

    Hayashi, S.-i., T. Sakamoto, et al. (2003). "Estrogen and growth factor signaling pathway: basic approaches for clinical application." The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 86(3-5): 433-442.

    Lin, L. F., D. H. Doherty, et al. (1993). "GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons." Science 260(5111): 1130-1132.

    Lonka-Nevalaita, L., M. Lume, et al. (2010). "Characterization of the intracellular localization, processing, and secretion of two glial cell line-derived neurotrophic factor splice isoforms." The Journal of neuroscience 30(34): 11403-11413.

    Meredith, G. E. and H. Steiner (2006). "Amphetamine increases tyrosine kinase-B receptor expression in the dorsal striatum." Neuroreport 17(1): 75-78.

    Moore, M. W., R. D. Klein, et al. (1996). "Renal and neuronal abnormalities in mice lacking GDNF." Nature 382(6586): 76-79.

    Pichel, J. G., L. Shen, et al. (1996). "Defects in enteric innervation and kidney development in mice lacking GDNF." Nature 382(6586): 73-76.

    Sanchez, M. P., I. Silos-Santiago, et al. (1996). "Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF." Nature 382(6586): 70-73.

    Schuchardt, A., V. D'Agati, et al. (1994). "Defects in the kidney and enteric nervous system of mice lacking the tyrosine kinase receptor Ret." Nature 367(6461): 380-383.

    Slevin, J. T., G. A. Gerhardt, et al. (2005). "Improvement of bilateral motor functions in patients with Parkinson disease through the unilateral intraputaminal infusion of glial cell linederived neurotrophic factor." Journal of neurosurgery 102(2): 216-222.

    Tepper, J. M. and J. P. Bolam (2004). "Functional diversity and specificity of neostriatal interneurons." Current opinion in neurobiology 14(6): 685-692.

    Toledo-Aral, J. J., S. Mendez-Ferrer, et al. (2003). "Trophic restoration of the nigrostriatal dopaminergic pathway in long-term carotid body-grafted parkinsonian rats." The Journal of neuroscience 23(1): 141-148.

    Tomac, A., E. Lindqvist, et al. (1995). "Protection and repair of the nigrostriatal dopaminergic system by GDNF in vivo." Nature 373(6512): 335-339.