Resumen de Clonado, expresión, caracterización y modelización de la ADN Topoisomerasa I en el Tripanosomátido "Leishmania infantum"
La ADN topoisomerasa I cataliza la relajación de ADN superenrollado mediante un mecanismo de corte transitotio en una hebra y la formación de un enlace fosfodiéster entre el extremo del ADN y la tirosina del centro activo. Una característica común a las ADN topoisomerasas I eucariotas es la presencia de un centro activo TSK-NY con la tirosina como aminoácido catalítico.
La camptotecina (CPT) es un veneno específico de ADN topoisomerasas I que estabiliza de manera reversible el intermediario covalente enzima-ADN inhibiendo el religado del ADN. Aunque la estabilización del intermediario covalente no es citotóxica per se, la letalidad de la CPT se explica durante la fase S del ciclo celular, por su interferencia con el avance de la horquilla de replicación, lo que provoca la conversión del corte de una única cadena del ADN en un corte de la doble cadena del ADN potencialmente letal. Todo ello produce la interrupción del ciclo celular en fase G2 y posteriormente muerte celular.
Los promastigotes de Leishmania infantum mostraron sensibilidad frente a CPT, con una EC50 menor de 0,5 uM, prueba de la existencia de una ADN topoisomerasa I en este parásito.
En primer lugar se clonó el gen codificante de la subunidad A (TOP1A) que presentó gran homología con distintas ADN topoisomerasas eucariotas pero que carecía del grupo conservado TSK-NY, dando lugar a distintas teorías sobre la reconstrución de una topoisomerasa activa en este parásito para posteriormente clonar u nuevo gen, TOP 1B, que contiene el grupo TSKINY.
Así pues, L.infantum posee una ADN topoisomerasa I heterodimétrica, constituída por dos subunidades estructurales diferentes.
La subunidad A porta los sitios de unión al ADN (dominio "core") y la subunidad B el centro catalítico (dominio C-terminal). En un sistema de expresión en levaduras, los lisados procedentes de la sobreexpresión de los genes TOP1A y TOP1B por separado no condujeron a la producc
