Resumen de Chem-NAT: A unique chemical approach for nucleic acids testing
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Resumen Los test de ácidos nucleicos, “NAT”, hacen referencia a las técnicas moleculares que se utilizan para la identificación de especies patógenas como bacterias y virus así como para la identificación de biomarcadores relacionados con el desarrollo de enfermedades, por ejemplo cáncer; con la respuesta del organismo a un tratamiento farmacológico y la toxicidad del mismo. El uso de este tipo de ensayos está en aumento, especialmente en sistemas sanitarios con pocos recursos económicos, salud animal, seguridad alimentaria, desarrollo de fármacos por la industria farmacéutica…De hecho, los NAT suponen un mercado global en expansión que tendrá una tasa de crecimiento compuesta del 10% para 2020.
Dentro del mercado de los NAT, fundamentalmente basado en ensayos de PCR, se propone un nuevo tipo de NAT que no depende por completo de amplificación de la diana por PCR. Se trata de un nuevo enfoque de NAT basado en un proceso de química dinámica y en el que se utilizan sondas de PNA abásicas (sondas DGL) y bases nitrogenadas modificadas con un grupo aldehído (SMART-Nucleobases, SMART-NBs), permite la “lectura” de ácidos nucleicos con resolución de una sola base. La especificidad de la metodología propuesta se debe al hecho de que deben cumplirse 2 requisitos para obtener una señal: 1) una hibridación perfecta entre una sonda DGL y su ácido nucleico diana y 2) una incorporación específica y controlada termodinámicamente de una SMART-NB en la posición abásica de una sonda DGL que debe ser complementaria, según las reglas de apareamiento de bases propuestas por Watson y Crick, a la del nucleótido estudiado en el ácido nucleico diana. Como consecuencia de estos requisitos, se minimizan las posibilidades de obtener falsos-positivos.
El objetivo de este proyecto era desarrollar nuevos ensayos moleculares que basados en este enfoque químico ofreciesen alternativas de diagnóstico capaces de identificar rápidamente tanto patógenos como biomarcadores circulantes. Los nuevos ensayos moleculares propuestos tienen como objetivos aportar beneficios a nivel económico, reducir el tiempo necesario para la obtención de los resultados así como proporcionar una mayor consistencia de los mismos y simplificar los ensayos de modo que no sea necesario la utilización de equipos o la intervención de personal altamente especializados.
Se han estudiado dos ácidos nucleicos diferentes: a) miR-122, un microRNA hepato-específico propuesto como biomarcador de daño hepático inducido por fármacos ya que es mucho más sensible y específico que otros biomarcadores actualmente utilizados en clínica como ALT o AST. Además, podría utilizarse en los procesos de desarrollo de fármacos para determinar la toxicidad celular in vitro. Para conseguir este objetivo, se seguirá la primera estrategia desarrollada durante esta tesis ‘Single Nucleobase Labeling’ –“marcaje de una sola nucleobase”-.
b) El gen que codifica para el RNA ribosomial 28S: L. major, T. brucei and T. cruzi. Se trata de tres especies de parásitos relacionadas filogenéticamente , con una alta homología de secuencia y que causan enfermedades devastadoras. Debido a su alta homología pueden dar lugar a reacciones cruzadas y un diagnóstico erróneo lo que supondría instaurar un tratamiento farmacológico inadecuado y sufrir no sólo los efectos de la enfermedad sino también los efectos secundarios del tratamiento. Para abordar este problema, durante la tesis se desarrolló el concepto de ‘Single Nucleotide Fingerprint’ –huella nucleotídica única-.
La tecnología propuesta para la “lectura” química de ácidos nucleicos se integró en diferentes plataformas, algunas de las cuales ya estaban siendo utilizadas en laboratorios de diagnóstico, para conseguir así expandir su utilidad y poder desarrollar nuevos test de diagnóstico.
a) In-Check™ LoC de STmicroelectronics® para una detección fluorescente de miR-122.
b) Microesferas Magplex® de Luminex® para una detección fluorescente de miR-122 usando microesferas como plataforma.
c) Reacción en solución con detección mediante espectrometria de masas MALDI-TOF para la identificación y diferenciación de tres especies de tripanosomatidos: L. major, T. brucei and T. cruzi.
d) Sistema HibridSpot™12 (tecnología “DNA flow”) del grupo Vitro® para el desarrollo de un test colorimétrico para la diferenciación de L. major and T. cruzi.
Los resultados obtenidos de este proyecto fueron utilizados como punto de partida por DestiNA Genomica S.L. En relación al ensayo utilizado microesferas como plataforma, se ha llevado a caba la detección de miR-122 en suero de pacientes utilizado una nueva plataforma, SiMoA™. Por otro lado, el test colorimétrico desarrollado para la diferenciación de parásitos tripanosomátidos se ha adapatado a una nueva plataforma más sencilla y que proporciona resultados más reproducibles, específicos y precisos, “DesitNA-spin-tube”. El producto final podría convertirse en el primer producto comercializado por DestiNA Genomica S.L.
- English
Abstract Nucleic acid tests, “NAT”, refers to molecular techniques to detect nucleic acid used to identify pathogenic species such as bacteria and viruses and also genetic biomarkers related to diseases, such as cancer, drug performances and drug toxicities. This kind of assays is increasingly being used as routine tests in the cost challenged medical health systems, animal health, food safety and drug development by pharmaceutical companies. NAT has created an expanding global market which will grow at a compound annual growth rate (CAGR) of nearly 10% by 2020.
Within the PCR-based dominated NAT market, a new type of NAT, which does not fully rely on PCR, has been recently proposed. The chemistry-based approach is based on dynamic chemistry and uses abasic PNA probes (DGL probes) and aldehyde-reactive modified nucleobases (SMART-Nucleobases, SMART-NBs), allowing nucleic acid reading with single-base resolution. The specificity of the method relies on two steps which need both to occur in order to create a readable signal: 1) perfect hybridization between a DGL probe and its target nucleic acid and 2) a specific thermodynamic-controlled incorporation to the DGL probe of a SMART-NB which is complementary to the nucleotide under interrogation following Watson-Crick base pair ruling. As a result, the system removes the chances of a false-positive result.
The aim of this project was to develop new molecular assays, based on this chemistry-based approach, which offered diagnostic capabilities for rapid identification of both pathogens and circulating biomarkers. These new molecular assays aimed to offer advantages in terms of result consistency, time, cost and ease of use.
Two different target nucleic acids were studied: a) miR-122, a hepato-specific microRNA which is an early and more sensitive indicator of drug-induced liver injury than other currently used biomarkers such as ALT or AST. It can be also used in drug-development processes to assess in vitro cellular toxicity. To do so, the ‘Single Nucleobase Labeling’ (SNL) approach was first developed during this thesis.
b) Trypanosomatids 28S ribosomal RNA coding gene: L. major, T. brucei and T. cruzi. Three closely related species with high homology gene sequences which cause devastating diseases. They can give cross-reaction and so misdiagnosis which would result in an ineffective drug-based treatment, suffering the side effects and the disease symptoms. To tackle this issue, the ‘Single Nucleotide Fingerprints’ concept was developed for the first time during this thesis.
The chemistry-based technology for nucleic acid testing was integrated within different platforms, which were already used in diagnostic laboratories, to expand their utility and thus develop novel diagnostic tests. The tested platforms were: a) In-Check™ LoC from STmicroelectronics® for an array-based fluorescence-based detection of miR-122 b) Magplex® microspheres from Luminex® for a bead-based fluorescent assay for the detection of miR-122.
c) Reaction in solution using MALDI-TOF mass spectrometry as readout tool for the identification and differentiation of three trypanosomatid species L. major, T. brucei and T. cruzi.
d) HibridSpot™12 (DNA flow) system from Vitro® group for an array-based colorimetric assay for the differentiation of trypanosomatids L. major and T. cruzi.
The results obtained from this project were undertaken by DestiNA Genomica S.L. Regarding the bead-based assay, a new platform, SiMoA™, has been successfully used to detect miR-122 from patients serum. On the other hand, the colorimetric-based assay for trypanosomatid differentiation has been adapted to a more reproducible, specific, accurate and easier to perform platform, DestiNA spin-tube. This final product might be the first product commercialized by DestiNA Genomica S.L.
