Genomic, transcriptomic and proteomic analysis of "Pleurotus ostreatus" secreted proteins
- Autores: Manuel Alfaro Sánchez
- Directores de la Tesis: Antonio Gerardo Pisabarro de Lucas (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Pública de Navarra ( España ) en 2017
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Ángel Tomás Martínez Ferrer (presid.), Estibaliz Larrainzar Rodriguez (secret.), Tania Kristina Lundell (voc.)
- Programa de doctorado: Programa Oficial de Doctorado en Biotecnología
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Academica-e
- Resumen
El objetivo de esta tesis es estudiar las proteínas secretadas por el hongo basidiomiceto de la podredumbre blanca Pleurotus ostreatus, un excelente comestible ampliamente cultivado por todo el mundo, con tres objetivos principales: determinar el conjunto de proteínas secretadas en diferentes condiciones nutricionales, determinar el efecto de las cepas monocarióticas o dicarióticas en el secretoma, y explorar la relación entre el transcriptoma de las proteínas secretadas y su presencia en diferentes medios de cultivo.
En el primer capítulo de esta tesis, revisaremos varios análisis de secretomas de basidiomicetos comparando los resultados obtenidos utilizando diferentes técnicas analíticas y discutiendo algunos ejemplos representativos. Prestaremos especial atención a las enzimas lignocelulolíticas secretadas y a los diferentes estilos de vida fúngicos. Este capítulo es una versión actualizada del artículo titulado "Comparative analysis of secretomes in basidiomycete fungi" que publicamos en Joumal of Proteomics en 2014 como una revisión. En este capítulo, concluimos que una combinación de técnicas genómicas, transcriptómicas y proteómicas sigue siendo el mejor enfoque para analizar secretomas fúngicos, y para permitir la identificación de patrones de secreción asociados a los diferentes estilos de vida.
En el tercer capítulo, hemos seleccionado dos genomas monocarióticos de P. ostreatus para identificar bioinfonnáticamente los genes que codifican las proteínas dirigidas a la secreción. El estudio se realizó utilizando los dos protoclones monocarióticos (rnkPC9 y mkPC 15) cuyos genomas habían sido previamente secuenciados y anotados en un proyecto colaborativo llevado a cabo con el Joint Genome Institute. Estos dos protoclones contienen los dos núcleos presentes en las cepas dicarióticas de la cepa comercial dkNOO l. Los resultados obtenidos mostraron que, sorprendentemente , ambas cepas difieren en sus capacidades genómicas para degradar lignocelulosa. mkPC9 tiene menos genes CAZy anotados, especialmente glycosil hidrolasas (GH). Sin embargo, crece mejor que rnkPC15 sobre sustratos lignocelulósicos y tiene una mayor capacidad de secreción enzimática cuando crece en presencia de madera. La transcripción de los genes codi:ficantes para proteínas secretables fue estudiada por RNAseq, y se observa que mientras número de genes clasificados para cada función es similar en las dos cepas, los correspondientes perfiles transcriptómicos son diferentes entre ellos y también diferentes según las condiciones de cultivo. La actividad transcripcional se concentra en pocos genes por función, y se observa que las glicosil hidrolasas y proteínas sin una clasificación funcional tienen una mayor importancia de lo que se infería analizando su número. Estos resultados ponen de relieve la importancia de agregar datos adicionales a las listas de genes producidos por el análisis genómico para obtener una imagen más precisa del proceso biológico en estudio.
P. ostreatus secreta una gran variedad de enzimas degradadoras de lignocelulosa cuando se cultiva en presencia de madera. Más del 20% de ellos carece de una función enzimática conocida. El análisis de transcriptoma subraya la importancia de estas proteínas, confirmada además por la proteómica. Usando la predicción de la estructura del dominio, pudimos inferir el posible papel de varias proteínas, incluyendo una xilanasa y un AAl O LPMO. Este capítulo es una versión del manuscrito titulado "Comparative and transcriptional analysis of the predicted secretome in the lignocellulose-degrading basidiomycete fungus Pleurotus ostreatus"publicado en Environmental Microbiology en 2016.
Finalmente, en el cuarto capítulo, se utilizaron análisis de espectrometría de masas para confirmar la presencia de estas enzimas actuando sobre los sustratos lignocelulósicos. Las tres cepas se cultivaron en tres medios diferentes usando glucosa, madera o ambos (glucosa y madera) como fuente de carbono. Como era de esperar, identificamos un mayor número de enzimas de degradación de lignocelulosa en medios que contienen madera, especialmente glicosil hidrolasas, carbohidrato esterasas y polisacárido liasas.
Además, observamos que las tres cepas se comportan de manera diferente. mkPC15 mostró una producción más débil de enzimas de degradación de lignocelulosa que mkPC9 y dkNOO 1 cuando se cultivó usando madera como fuente de carbono. Además, dkNOO 1 fue capaz de secretar más enzimas de descomposición de la pared celular de las plantas, como corresponde a su mayor capacidad para crecer en sustratos lignocelulósicos.
La degradación fúngica de la lignocelulosa es el resultado de la acción sinérgica de varias enzimas.Esta tesis mejora nuestra comprensión general de la degradación de la biomasa vegetal para lograr el objetivo de utilizar la biomasa como una fuente sostenible de energía para el futuro.
