Resumen de Homeostasis de Na+ y K+ mediante transportadores de Na+ de tipo HKT1 y su papel en la tolerancia del tomate a la salinidad
TÍTULO DE LA TESIS DOCTORAL:
Homeostasis de Na+ y K+ mediante transportadores de Na+ de tipo HKT1 y su papel en la tolerancia del tomate a la salinidad.
INTRODUCCIÓN Y MOTIVACIÓN DE LA TESIS:
La salinidad de los suelos y de las aguas de riego es uno de los principales factores ambientales causantes de la reducción del crecimiento y de la producción vegetal a escala mundial, afectando a un gran número de cultivos de interés agrícola. Este factor afecta especialmente a las comunidades andaluza (principalmente en la franja costera de las provincias de Almería, Granada y Málaga) y murciana, donde se encuentran las zonas de mayor producción hortofrutícola, no sólo de España, sino también de Europa. La salinidad limita la productividad y calidad de las cosechas, disminuyendo su rendimiento y calidad, por lo que los principales motores de la economía en estas zonas se ven seriamente amenazados (Tóth et al., 2008). Una de las principales causas de salinización de los suelos cultivables se debe a un mal uso de las aguas de riego, problema que se agudiza especialmente en las franjas costeras, donde la sobreexplotación de los acuíferos produce la salinización de los suelos por intrusión de agua de mar (Tuteja, 2007). Se estima que el coste por pérdidas en producción agraria debidas a la salinidad a nivel mundial es de unos 27 mil millones de dólares anuales y va en aumento (Munns y Gilliham, 2015). Por tanto, el incremento del uso eficiente del agua en Agricultura es un objetivo de primer orden para garantizar la sostenibilidad, producción de riqueza y empleo de los distintos sectores económicos de las zonas mencionadas (FAO, 2011).
El cultivo del tomate es uno de los más extendidos en la actualidad y de mayor valor económico (FAO, 2014). Su demanda aumenta continuamente y con ella su cultivo, producción y comercio. Actualmente, España es el octavo país más productivo de tomate a nivel mundial, siendo su producción principalmente destinada al consumo en fresco. Por tanto, este cultivo es promotor de riqueza y empleo en este país, especialmente en las zonas previamente mencionadas. Sin embargo, en dichas zonas encontramos frecuentemente valores de conductividad superiores a 3 dS/m (equivalentes a unos 2 g/L de NaCl), tanto en suelos como en el agua de riego, que ocasionan disminuciones muy importantes en la producción de dicho cultivo. Concretamente, a partir de valores de 1.7 dS/m, la producción de tomate disminuye un 15% por cada dS/m adicional (Maas y Grieve, 1990). Esta situación hace necesaria la búsqueda de soluciones que permitan mejorar la tolerancia a la salinidad de este cultivo (Cuartero et al., 2006; Bergougnoux, 2014).
Para la mayoría de plantas de cosecha y, particularmente para el tomate, la excesiva acumulación de Na+ puede producir efectos muy negativos en su crecimiento y desarrollo, debido esencialmente a la competición de este catión con el K+ por los sistemas de absorción del segundo. Si bien, dicha acumulación podría considerarse una ventaja adaptativa, por ser el Na+ un osmolito biológicamente barato que restaura el estado hídrico de la planta, una regulación inadecuada de los flujos de Na+ causaría a largo plazo una deficiencia nutricional de K+ y una perturbación del potencial osmótico de la célula, tanto por la elevada concentración de Na+ externa, como por la disminución de la concentración del K+ en el interior de la misma (Munns et al., 2016; Kronzucker et al., 2013). En este sentido, la mejora de la homeostasis de Na+/K+ es un aspecto clave en la tolerancia a la salinidad del tomate (Cuartero et al., 2006).
Para reducir el impacto de la salinidad en el tomate se han implementado estrategias tecnológicas y biológicas (Romero-Aranda et al., 2002, 2006; Cuartero et al., 2006). Las estrategias biológicas, que son de gran importancia en la agricultura sostenible, han consistido en utilizar el potencial genético de las variedades de cultivos y especies relacionadas para la identificación de características de tolerancia y su introgresión en los cultivos mediante mejora clásica o bien mediante su manipulación por ingeniería genética (Mickelbart et al., 2015). En el tomate se han identificado fuentes genéticas de variación para la tolerancia a la sal en algunas especies silvestres, como Solanum pimpinellifolium y S. cheesmaniae, que podrían actuar como donantes de esta característica a cultivares de tomate de interés comercial (Cuartero et al., 2006). Las especies de tomate tienen una amplia diversidad genotípica para controlar el transporte de Na+ a larga distancia cuando se cultivan bajo condiciones de estrés salino, siendo generalmente las accesiones más tolerantes aquellas que acumulan más sal en tallos y hojas y menos en las raíces en comparación con las variedades más sensibles (Cuartero et al., 2006). De hecho, las raíces de tomate pueden, en gran medida, determinar las concentraciones de Na+ que alcanzan la parte aérea de la planta, dependiendo de la intensidad del estrés (Estañ et al., 2005; Asins et al., 2010, 2015).
OBJETIVOS Y DESARROLLO TEÓRICO:
Por todo lo anteriormente mencionado, el objetivo fundamental del grupo de investigación Homeostasis Iónica y Transportadores de Membrana de la EEZ, en el cual se ha llevado a cabo la presente Tesis Doctoral, es el estudio de aquellos genes que codifican a diferentes transportadores de Na+, K+ y H+ de plantas, implicados en la homeostasis de Na+ y K+, que pueden ser claves en el mecanismo de tolerancia de las plantas a la salinidad. Concretamente, en esta Tesis se han estudiado los transportadores de tipo HKT en tomate (una especie de gran interés agronómico), ya que se ha visto que en otras plantas como Arabidopsis y cereales parecen jugar un importante papel en el control de la carga xilemática de Na+ y el transporte de este catión a larga distancia (Ren et al., 2005; James et al., 2006; Byrt et al., 2007; Xue et al., 2011; Munns et al., 2012).
Es importante destacar el establecimiento de una colaboración científica entre el mencionado grupo y el Grupo de Genética de la Dra. MJ Asíns (IVIA, Valencia), que ha sido esencial para la validación de los genes de tomate SlHKT1;1 y SlHKT1;2, aislados y caracterizados funcionalmente en el presente trabajo, como genes candidatos en el análisis de QTLs de tolerancia a la salinidad en dos poblaciones de líneas recombinantes (RILs, del inglés Recombinant Inbred Lines), derivadas de las especies halotolerantes S. pimpinellifolium y S. cheesmaniae. Así, el grupo del IVIA había encontrado una agrupación de QTLs localizados en el cromosoma 7, concretamente el QTL mayoritario lkc7.1, que bajo condiciones salinas determina una mayor acumulación de Na+ y una menor de K+ en hojas en líneas RILs de la especie cultivada S. lycopersicum cv. Cerasiforme que portan una introgresion cromosómica de cheesmaniae en dicha región (Villalta et al., 2008). Esta información genética previa, junto a la información molecular sobre las dos isoformas de la familia HKT de tomate (SlHKT1;1 y SlHKT1;2), aportada al inicio de este trabajo, mostró que en aquella región genómica, estrechamente asociada a dicho QTL, subyacen, solos o con otros genes, ambas isoformas de HKT. Según esta información y la descrita previamente sobre este tipo de transportadores en otras especies, como Arabidopsis y cereales, las variantes alélicas de HKT1;1 y/o HKT1;2 parecen constituir los candidatos más probables a soportar la función del mencionado QTL de tolerancia a la salinidad, siendo ésta la hipótesis de partida de la presente Tesis Doctoral.
Por tanto, el objetivo general de esta Tesis Doctoral ha sido el estudio del papel de los genes de tipo HKT1 y sus variantes alélicas (alelos lycopersicum y cheesmaniae) en el transporte de Na+ a larga distancia y su implicación en el mencionado QTL mayoritario relacionado con la tolerancia del tomate a la salinidad. Para ello se ha realizado un abordaje funcional in planta, mediante el análisis de fenotipos de pérdida de función (silenciamiento estable por RNAi), disponiéndose de material vegetal generado por el grupo de Genética del IVIA. Asímismo, estudios funcionales previos realizados en tomate han indicado que SlSOS1 juega un papel relevante en la distribución de Na+ en los diferentes órganos de la planta e indirectamente en la nutrición del K+. Por ello, también se ha investigado la posible coordinación de las funciones de SOS1 y HKT1 en la determinación de la cantidad de Na+ que llega a los tejidos fotosintéticos. Todo ello podría generar información clave para contribuir a la mejora de la tolerancia del tomate a la salinidad y, por tanto, al aumento de su producción y la mejora de su calidad. Es decir, factores de halotolerancia presentes en especies silvestres como S. pimpinellifolium y S. cheesmaniae, podrían ser transferibles, mediante cruzamientos y selección asistida por marcadores moleculares o por ingeniería genética, a las variedades cultivadas de élite (Asíns, 2002; Cuartero et al., 2006; Salvi y Tuberosa, 2007).
Este objetivo general se ha desglosado en los siguientes objetivos específicos, dando lugar al correspondiente plan de trabajo:
1. Análisis molecular de SlHKT1;1 y SlHKT1;2 y expresión funcional en levaduras. Se ha analizado la actividad, modo de transporte y especificidad de sustrato (K+ y/o Na+) de SlHKT1;1 y SlHKT1;2 mediante expresión heteróloga en lavaduras.
2. HKT1;1/HKT1;2 como genes candidatos responsables del QTL mayoritario, lkc7.1, que determina la concentración de Na+/K+ en la parte aérea de tomate. Este objetivo se dividió a su vez en dos subobjetivos:
2.1. Análisis molecular de Sc/SlHKT1;1 y Sc/SlHKT1;2 y expresión funcional en levaduras. Se han analizado, en las dos variantes alélicas de ambas isoformas, las diferencias en las secuencias genómicas y/o de expresión que pudieran reportar características bioquímicas diferenciales que explicasen su contribución fisiológica al QTL lkc7.1. Dichas características, actividad, modo de transporte y especificidad de sustrato (K+ y/o Na+), se evaluaron mediante la expresión de cada una de las variantes alélicas en levadura.
2.2. Análisis funcional de Sc/SlHKT1;1 y Sc/SlHKT1;2 “in planta” mediante silenciamiento génico por RNAi. Se ha estudiado la contribución de ambos isogenes a dicho QTL mediante el silenciamiento estable mediado por Agrobacterium tumefaciens (construcciones hairpin-RNAi) de la expresión de cada uno de ellos en dos líneas casi-isogénicas (NILs) de tomate. Estas NILs se diferencian únicamente en que una de ellas porta los alelos de S. cheesmaniae, una especie silvestre halotolerante, mientras que la otra, los alelos de la especie cultivada S. lycopersicum de ambos isogenes, todos ellos en homozigosis, en la región que subyace al QTL ubicado en el cromosoma 7 de tomate (Villalta et al., 2008).
3. Coordinación de SOS1 y SlHKT1 en el transporte de Na+ y K+ a larga distancia. Se ha estudiado la existencia de una posible coordinación entre dichos transportadores en el control del transporte de Na+ a larga distancia, e indirectamente del de K+, un aspecto que parece clave en la tolerancia del tomate a la salinidad. Para ello, se determinó en qué tejidos se localizaba la expresión de los genes HKT1 y SOS1, mediante la técnica de RT-PCR in situ y se analizó el perfil de expresión de los genes HKT1;1 y HKT1;2, en función del estadío de desarrollo de los órganos de la planta, en una línea de tomate silenciada para el gen SlSOS1, previamente generada en nuestro laboratorio (Olías et al., 2009a, 2009b).
CONCLUSIONES:
1. El análisis filogenético de las secuencias aminoacidícas, los ensayos de transporte mediante expresión heteróloga en levaduras y los experimentos de localización mediante RT-PCR in situ han demostrado que los genes HKT1;1 y HKT1;2 aislados de tomate, son transportadores selectivos para el Na+, pertenecientes a la subfamilia 1 de transportadores HKT de plantas superiores. Dada su expresión en el sistema vascular de la raíz y parte aérea, incluyendo las células del xilema y quizás las del floema, así como su similaridad funcional a otros transportadores de Na+ ya caracterizados de esta subfamilia, podemos decir que SlHKT1;1 y/o SlHKT1;2 participan en la descarga/retirada de Na+ del xilema de la raíz y la parte aérea (y posiblemente en la carga floematica).
2. Los datos genéticos relacionados con la proximidad a la posición genética y física con el máximo LOD correspondiente, así como el análisis de expresión génica, apoyan la hipótesis de que los genes HKT1;1 y/o HKT1;2 son los principales responsables de un grupo de QTLs mayoritarios, particularmente del lkc7.1, localizados en el cromosoma 7, implicados en la homeostasis de Na+ y K+ de la parte aérea de tomate. En condiciones salinas, dicho QTL lkc7.1 viene determinado por los alelos HKT1 introgresados de S. cheesmaniae, que permiten el almacenamiento de más Na+ y menos K+ en la parte aérea de la planta de NIL14, mientras que los alelos HKT1 de S. lycopersicum tienen el efecto contrario en la NIL17. Esto concuerda con el hecho de que la expresión de ScHKT1;2 en NIL14 fue mucho menor en raíz y mayor en la hoja, contrariamente a la de SlHKT1;2 en NIL17, mientras que la de ScHKT1;1 fue mayor tanto en hoja como en raíz de NIL14 que la de SlHKT1;1 en NIL17. Dado que los niveles de transcritos de HKT1;2 fueron siempre mucho más altos que los de HKT1;1 en todas las líneas y tejidos analizados, puede concluirse que dicho QTL es controlado esencialmente por un alelo cheesmaniae hipoactivo de HKT1;2, así como por un alelo hiperactivo lycopersicum de HKT1;2 en la raíz.
3. Los estudios de genética reversa mediante RNA de interferencia han revelado el importante papel que HKT1;2 juega la homeostasis de Na+ (y K+) y en la tolerancia a la salinidad del tomate. Así, el silenciamiento de HKT1;2 alteró la razón Na+/K+ y aumentó la sensibilidad a la salinidad, a diferencia del silenciamiento de HKT1;1, que no afectó de manera significativa a estos parámetros. Esto confirma que el gen HKT1;2 es responsable del principal QTL implicado en la homeostasis de Na+ y K+ en tomate. Además, el mayor efecto del silenciamiento del alelo de cheesmaniae de HKT1;2 (hipoactivo), en comparación con el alelo de lycopersicum (hiperactivo) en el crecimiento de las NILs de tomate en condiciones salinas sugiere un papel más relevante del alelo silvestre de HKT1;2 en la tolerancia a la salinidad.
4. La acción de este transportador HKT1;2, probablemente coordinada junto a la de otros transportadores de Na+, tales como SOS1 (que ejerce la función opuesta) y NHX4, es requerida para regular las concentraciones internas de Na+ en varios tejidos, e indirectamente las de K+, mediante procesos como la absorción/extrusión a través de la membrana plasmática, la compartimentación en las vacuolas de las células y la redistribución de iones a través de los órganos de la planta.
5. La isoforma HKT1;1, que se expresa en el mismo tipo de células vasculares que HKT1;2, parece jugar un papel secundario en el transporte de Na+ y en la homeostasis de Na+/K+ en la parte aérea de la planta. Asímismo, el hecho de que HKT1;1 se exprese mayormente en las hojas de las especies silvestres de tomate como S. cheesmaniae y S. pimpinellifolium, pero no en las de S. lycopersicum, sugiere que las especies cultivadas de tomate han divergido de ambas especies silvestres con respecto a la regulación de la expresión de HKT1;1. Ello apoya fuertemente la idea de que, durante el proceso de domesticación del tomate, se ha producido una reducción de la expresión de HKT1;1 en hojas (y posiblemente en raíces) y la fijación de un alelo HKT1;2 hiperactivo en las raices.
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PUBLICACIONES Y CONGRESOS:
Parte de los resultados presentados en esta Memoria de Tesis Doctoral han sido incluidos en las siguientes publicaciones, reuniones y/o congresos nacionales e internacionales:
PUBLICACIONES:
• Jaime-Pérez N, Pineda B, García-Sogo B, Atares A, Athman A, Byrt CS, Olías R, Asíns MJ , Gilliham M, Moreno V and Belver A (2017) The sodium transporter encoded by the HKT1;2 gene modulates sodium/potassium homeostasis in tomato shoots under salinity. Plant Cell & Environment 40: 658-671.
• Asíns MJ, Villalta I, Aly MM, Olías R, Álvarez De Morales P, Huertas R, Li J, Jaime-Pérez N, Haro R, Raga V, Carbonell EA and Belver A (2013) Two closely linked tomato HKT coding genes are positional candidates for the major tomato QTL involved in Na+/K+ homeostasis. Plant Cell & Environment 36: 1171-1191.
• Belver A, Olías R, Cagnac O, Aranda-Sicilia MN, Gálvez FJ, Ortega AP, Jaime-Pérez N, Aboukila A, Gaspar MI, Sánchez ME, Venema K and Rodríguez-Rosales P (2013) Microscopy to study ion homeostasis and membrane transporters. 30 years of (e-) microscopy at the EEZ in images. Editors: Antonio Jesús Castro López and Juan de Dios Alché Ramírez. Published by the Plant Reproductive Biology Research Group, Estación Experimental del Zaidín, pp 13-14. (ISBN 13: 978-84-616-7277-6).
CONGRESOS:
• Jaime-Pérez N, Pineda B, García-Sogo B, Ortega AP, Olías R, Atares A, Asins MJ, Moreno V and Belver A (2016) Role of HKT1-like Na+ transporters in tomato salt tolerance. VIII Reunión de Biología Molecular de Plantas (RBMP), 22-24 junio de 2016, Oviedo.
• Jaime-Pérez N, Athman A, Byrt C, Gilliham M, Roy S, Olías R, Asíns MJ and Belver A (2015) Localization of genes involved in K+/Na+ homeostasis in tomato by in situ PCR. VISCEA, Plant Abiotic Stress Tolerance III, 29 Junio-1 Julio de 2015, Viena.
• Jaime-Pérez N, Gálvez FJ, Olías R, Ortega AP, Pérez-Tienda J, Granum E and Belver A (2015) Functional relationship between SOS1 and HKT1-like transporters in long distance Na+ transport in tomato plants under saline conditions. XXI Reunión de la Sociedad Española de Fisiología Vegetal, XIV Congreso Hispano-Luso de Fisiología Vegetal, 14-17 Junio de 2015, Toledo.
• Pérez-Tienda J, Curado C, Sánchez-Gallardo R, González-Cañas G, Jaime-Pérez N, Traverso JA, Cano C, Bago A and Belver A (2015) Molecular basis of K+/Na+ homeostasis in arbuscular mycorrhyzal plants under saline conditions. XXI Reunión de la Sociedad Española de Fisiología Vegetal, XIV Congreso Hispano-Luso de Fisiología Vegetal, 14-17 Junio de 2015, Toledo.
• Clemente S, Maldonado Á, Vilchez P, Pérez E, López A, Jaime-Pérez N, Olías R, Belver A. (2014) Can we produce tomatoes with a pinch of salt? (Or how to reduce the negative impact of water and soil salinity on cultivated tomato) 3rd Congress PIIISA (Proyecto de Iniciación a la Investigación e Innovación en Secundaria en Andalucía), Facultad de Farmacia, Universidad de Granada (UGR), 22 Mayo de 2014, Granada.
• Asíns MJ, Villalta I, Olías R, Álvarez De Morales P, Huertas R, Jaime-Pérez N, Haro R, Raga V, Carbonell EA and Belver A (2013) HKT genes could underlie a major tomato QTL for shoot Na+/K+. Environment Workshop “Genomic, Physiological and Breeding Approaches For Enhancing Drought Resistance In Crops”, Universidad Internacional de Andalucía (UNIA), Septiembre de 2013, Baeza, Jaén.
• Belver A, Venema KM, Olías R, Cagnac O, Ortega A, Gálvez FJ, Abushamsiya K, Aboukila A, Jaime-Pérez N, Fernández TA and Rodríguez-Rosales P (2012). Na+ and K+ transporters involved in ionic homeostasis under saline conditions in Arabidopsis and Tomato. V Reunión de la Red de Estrés Abiótico de Plantas (REAP) CEBAS-CSIC, 19-21 Septiembre de 2012, Murcia.
