Zebrafish (danio rerio) as infection model to study the pathogenesis of the bacteria aeromonas hydrophila
- Autores: Paolo Roberto Saraceni
- Directores de la Tesis: Beatriz Novoa Garcia (dir. tes.), Miguel Alejandro Romero Jodár (dir. tes.), Antonio Figueras Huerta (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidade de Vigo ( España ) en 2017
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Giuseppe Scapigliati (presid.), María Teresa Pérez Nieto (secret.), Joan Tomás Magaña (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biotecnología Avanzada por la Universidad de A Coruña y la Universidad de Vigo
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Investigo
- Resumen
-La bacteria Aeromonas hydrophila es un patógeno de animales incluidos los seres humanos.
Aeromonas hydrophila es una bacteria Gram-negativa, miembro del género Aeromonas que está mundialmente distribuida en ambientes acuáticos como ríos, lagos y estuarios. Esta bacteria es un patógeno oportunista de peces, anfibios, reptiles, mamíferos y también está presente en el hombre. En algunas especies de peces como la carpa y el bagre, A. hydrophila provoca una enfermedad definida como septicemia por aeromonas móviles (MAS), que causa elevadas mortalidades en las granjas de cultivo y, por tanto elevadas pérdidas económicas.
La presencia natural de A. hydrophila en los ambientes acuáticos favorece la contaminación del agua potable y de los alimentos. La bacteria puede ser ingerida por estas vías y tener acceso al tracto gastrointestinal provocando diarrea. Puede producir tres tipos de infecciones gastrointestinales: la más común es la diarrea aguda autolimitada, es decir una diarrea acuosa que se resuelve en pocos días; la menos común es la forma disentérica que también incluye moco y sangre en las heces; mientras que la tercera enfermedad intestinal es la diarrea subaguda o crónica que puede durar desde 2 semanas hasta más de dos meses.
Por otra parte, las infecciones de heridas son causadas por la exposición de éstas al agua contaminada por A. hydrophila, durante actividades recreativas o laborales (por ejemplo la natación o pesca). Estas exposiciones causan infecciones de la piel y de los tejidos blandos subcutáneos produciendo una celulitis infecciosa. En el caso de personas inmunocomprometidas la infección se pueden propagar hacia capas más profundas de la piel llegando hasta el músculo y causando fascitis necrotizante o mionecrosis.
Además, A. hydrophila se ha relacionado con otras enfermedades menos frecuentes, como las infecciones hepatobiliares y pancreáticas, peritonitis, síndrome urémico-hemolítico, infecciones del tracto urinario, respiratorio y ocular. Las personas inmunocomprometidas que sufren cáncer, enfermedades hepáticas, diabetes o traumatismos, tienen un mayor riesgo de desarrollar sepsis y un desenlace fatal tras la infección. Por estas razones, la Agencia de Protección Ambiental (EPA) de Estados Unidos ha incluido a esta bacteria en el listado de contaminantes del agua potable.
Numerosos estudios han demostrado que la patogenicidad de A. hydrophila es multifactorial dependiendo de diferentes determinantes de virulencia entre los que se incluyen los LPS/O-antígeno, las fimbrias, los pili y factores de movilidad como los flagelos polar y lateral, la cápsula, la Capa S, el quórum sensing, la enterotoxina citotóxica Act, las enterotoxinas cytotonicas Ast y Alt, las hemolisinas alpha y beta, las toxinas Shiga, una variedad de proteasas, sideróforos y los sistemas de secreción como los tipos dos (T2SSs), tres (T3SSs) y seis (T6SSs). Estos factores contribuyen desde la adhesión, colonización e invasión de la bacteria al hospedador, hasta la degradación de los tejidos, la eliminación de las células y la modulación de las respuestas inmunológicas.
Teniendo en cuenta la peligrosidad de A. hydrophila para el hombre y la complejidad de sus componentes de virulencia, se hace necesario estudiar sus mecanismos patogénicos para desarrollar estrategias terapéuticas o profilácticas con el fin de contrarrestar o prevenir la infección. Para ello es de gran importancia una correcta selección del modelo animal utilizado para la experimentación. Este modelo animal debería hacer posible la reproducción de las infecciones naturales de A. hydrophila (infecciones orales y a través de heridas) para identificar los mecanismos de entrada y diseminación de la bacteria. Este modelo debería también permitir el análisis de la respuesta inmune del hospedador desencadenada tras la infección y mostrar las interacciones de las células del hospedador con el microbio in vivo. Además, dado que el mecanismo patológico de A. hydrophila es multifactorial dependiendo de varios factores de virulencia, el modelo animal debería permitir la evaluación y la comparación de la función de cada factor de virulencia para averiguar su exacta contribución en la enfermedad.
Durante los últimos años, el estudio de la patogénesis de A. hydrophila se ha realizado in vivo utilizando animales vertebrados e invertebrados, pero también in vitro en cultivos celulares. Los modelos de vertebrados más utilizados son los ratones y peces adultos. En estos modelos A. hydrophila ha sido administrada mediante inyecciones intramusculares o intraperitoneales. Posteriormente los animales se sacrifican y sus tejidos/órganos se extraen para llevar a cabo todos los análisis. Por lo tanto, hasta ahora no se ha podido realizar un estudio del proceso infeccioso en un animal entero mientras sigue vivo. Una de las limitaciones de estos modelos es que estos animales vertebrados no son transparentes.
Además, el tamaño de los ratones y peces y los requisitos éticos para su uso en experimentación limitan el número de animales que pueden ser empleados. Esto dificulta su aplicación en experimentaciones de alto rendimiento, como por ejemplo cuando se quiere evaluar la virulencia de varias cepas mutantes a la vez. Los modelos invertebrados como las amebas no poseen estas desventajas, pero, debido a su fisiología y anatomía, no se pueden utilizar para reproducir infecciones orales y de heridas. Por otro lado la gran limitación de los ensayos in vitro es la falta del contexto tisular que sin duda influye en la evolución de la infección.
Por todas estas razones, en la presente tesis se han elegido las larvas de pez cebra (Danio rerio) como modelo animal alternativo para estudiar la patogénesis de A. hydrophila. Dichas larvas poseen las ventajas de los modelos invertebrados como el tamaño pequeño y los bajos requisitos éticos. Además siendo vertebrados, su fisiología permite reproducir las infecciones naturales y estudiar la respuesta inmune desatada.
-El pez cebra como modelo animal alternativo para estudiar las infecciones producidas por Aeromonas hydrophila.
El pez cebra (Danio rerio) (Hamilton, 1822) es un pez teleósteo tropical de agua dulce perteneciente a la familia de los ciprínidos y ampliamente distribuido en el sur de Asia. En los últimos años la popularidad de esta especie como modelo animal para la investigación biomédica se ha incrementado porque su sistema inmune es muy similar al de los mamíferos. Así se considera un modelo válido para el estudio de enfermedades infecciosas en animales y en el hombre.
El pez cebra posee una inmunidad innata compuesta por los fagocitos tales como macrófagos y neutrófilos completamente funcionales desde 24-48 horas después de la fertilización, las citoquinas inflamatorias (por ejemplo il1b, tnf-a) y los receptores inmunes (por ejemplo los receptores tipo Toll). Este animal posee también una inmunidad adquirida a partir de las cuatro semanas después de la fecundación compuesta por células T y B con recombinación V (D) J dependiente de genes Rag.
El genoma del pez cebra es diploide y posee un alto grado de homología con el genoma humano. Así, el 70% de los genes humanos tienen al menos un ortólogo en el pez cebra. Estas características hacen que el pez cebra sea un modelo útil para estudiar muchas enfermedades humanas tales como enfermedades infecciosas, cáncer, trastornos cardiovasculares y neurodegenerativos. Se han obtenido resultados muy relevantes para los humanos en el estudio de las interacciones entre el sistema inmune y diversos patógenos con el uso del pez cebra. Este es el caso del estudio de la infección por Mycobacterium marinum como modelo de tuberculosis. Además el genoma del pez cebra está totalmente secuenciado y existen tecnologías muy eficientes de genética directa, mutagénesis dirigida estable y transitoria (por ejemplo la tecnología morfolino) que dan la posibilidad de hacer líneas mutantes knockout, knockdown (silenciación genética transitoria) y líneas transgénicas.
El pez cebra tiene otras características importantes, tales como su tamaño pequeño, fecundidad elevada, fertilización externa y ciclo de vida rápido que lo hacen adecuado para las aplicaciones experimentales a alto rendimiento. Además, no hay restricciones éticas para la experimentación con larvas de pez cebra, por lo que se pueden utilizar un gran número de animales en cada experimento. Por estas razones el pez cebra se considera un modelo animal válido para el estudio de infecciones que combina las ventajas de los modelos de invertebrados y vertebrados.
Por encima de todo, la característica más apreciada del pez cebra es la transparencia de sus embriones y larvas. Durante las primeras etapas desarrollo el pez cebra es transparente así que se puede ver a través de su cuerpo con un estereomicroscopio y esto es una clara ventaja en comparación con los modelos vertebrados tradicionales. La claridad óptica de las larvas y la disponibilidad de líneas transgénicas que expresan genes inmunes fluorescentes útiles para identificar específicamente leucocitos o citoquinas / quimioquinas, permiten el seguimiento, in vivo y en tiempo real, de los procesos inflamatorios mediante técnicas de microscopía de fluorescencia. El uso de patógenos fluorescentes acoplado a las técnicas de imagen de alta resolución (por ejemplo, microscopía confocal) permiten la observación de todas las interacciones entre el patógeno y el hospedador.
-Objectivos de esta tesis En este trabajo se han elegido las larvas del pez cebra como un modelo animal alternativo para estudiar las infecciones de Aeromonas hydrophila con el fin de: • desarrollar un modelo de infección in vivo para estudiar la patogénesis de la cepa septicémica A. hydrophila AH-1 y la respuesta inmune del hospedador provocada por la bacteria; • estudiar la implicación de los factores de virulencia de A. hydrophila AH-1 en las infecciones orales y de heridas; • evaluar el papel del nivel de glicosilación de la flagelina de la cepa gastroenterica A. hydrophila AH-3 en la respuesta inmune de las larvas mediante análisis de microarrays.
-Capitulo II. Establecimiento de modelos de infección en larvas del pez cebra (Danio rerio) para estudiar la patogénesis de la bacteria Aeromonas hydrophila.
En este capítulo, se han utilizado larvas del pez cebra a los 2-3 días post-fertilización para desarrollar dos modelos de infección con la cepa septicémica A. hydrophila AH-1; uno por microinyección y otro por baño.
La microinyección es una técnica que permite administrar pequeñas dosis de patógeno en diversos sitios anatómicos de larvas provocando diferentes tipos de infecciones. En este trabajo, las larvas se microinyectaron en la notocorda y el músculo para producir una infección local y directamente en el torrente sanguíneo, mediante la inyección en el conducto de Cuvier y en la vena caudal, para producir una infección sistémica. Se ha demostrado que A. hydrophila produce mortalidades en todas estas infecciones.
La eficacia de este modelo para estudiar la respuesta inmune del hospedador frente A. hydrophila fue validada midiendo dos componentes celulares y moleculares cruciales de los procesos inflamatorios: la respuesta de los neutrófilos y la inducción de la expresión del gen de la interleuquina-1beta (il1b). Para ello se utilizaron dos líneas transgénicas de pez cebra: la línea Tg(mpx:GFP) que posee neutrófilos verdes fluorescentes y la línea Tg(il-1b:GFP) que expresa la proteína verde fluorescente cuando el promotor de la il1b es activado, pudiendo visualizar así los sitios de las larvas donde se induce la expresión de este gen. Se observó y midió el nivel de fluorescencia por microscopía de fluorescencia gracias a la transparencia de las larvas.
Las imágenes mostraron que los neutrófilos migran rápidamente a los sitios anatómicos de inyección en las infecciones locales, mientras que en las infecciones sistémicas a través de la vena caudal y del conducto de Cuvier se produce un aumento generalizado del número total de neutrófilos.La infección de larvas Tg(il-1b:GFP) en el músculo y en la notocorda indujo la expresión de il1b principalmente alrededor del sitio de infección, mientras las inyecciones sistémicas en la vena caudal y en el conducto de Cuvier indujeron un patrón de expresión de il1b completamente diferente e inesperado. Se observó una elevada señal de fluorescencia lo largo del intestino y diferentes niveles de expresión en las branquias y en la aleta caudal. Estas diferencias en los fenotipos inmunes en larvas infectadas evidenciaron la complejidad de los mecanismos inmunológicos y demostraron la gran utilidad de la transparencia de este modelo animal. La inducción de la expresión de la il1b y la variación del número de neutrófilos y su migración a los sitios de infección, confirmaron la idoneidad de este modelo para estudiar las respuestas inmunes desencadenadas por esta bacteria.
La inyección en el conducto de Cuvier fue seleccionada para los siguientes experimentos por ser la ruta más fácil para realizar una infección sistémica. Las inyecciones en el conducto de Cuvier demostraron que A. hydrophila produce infecciones estables e induce mortalidades robustas y reproducibles dependientes de la dosis. El análisis de la expresión génica de larvas infectadas mediante PCR cuantitativa mostró la inducción de los genes proinflamatorios il1b y tnfa (factor de necrosis tumoral alfa). Además, el rápido aumento del número total de los neutrófilos visualizado en las larvas Tg(mpx:GFP) infectadas, evidenció que la inyección de A. hydrophila induce una rápida respuesta inflamatoria sistémica mediada por neutrófilos. La migración local temprana al sitio de inyección demostró la idoneidad del conducto de Cuvier también para el estudio de infecciones locales. Se realizaron estudios inmunohistoquímicos adicionales para analizar la fluorescencia intestinal observada en larvas infectadas por vía sistémica. El modelo de pez cebra ofrece técnicas ampliamente desarrolladas para la realización de estudios inmunohistoquímicos en larvas enteras mediante el uso de anticuerpos fluorescentes que marcan específicamente componentes celulares y tejidos que se pueden visualizar fácilmente mediante microscopía de fluorescencia.
Los estudios inmunohistoquímicos de larvas dobles transgénicas Tg(mpeg1:mcherryF/il-1b:GFP) que poseen macrófagos rojos fluorescentes y il1b verde permitió analizar en detalle el patrón de expresión de la il1b en larvas infectadas en el conducto de Cuvier mediante microscopía confocal. Las imágenes demostraron que la il1b se expresaba específicamente en las branquias, en todo el epitelio intestinal y en la piel. Esta es la primera vez que se observa este fenotipo inmune en larvas del pez cebra tras una infección bacteriana sistémica. Además, este experimento demostró la capacidad de A. hydrophila en inducir inflamación intestinal sin tener contacto directo con el sistema gastroentérico del animal ya que A. hydrophila no colonizó el intestino permaneciendo confinada en los vasos sanguíneos.
A. hydrophila es una bacteria que vive en el agua, su naturaleza acuática favorece la difusión en el agua potable y los alimentos a través de los cuales puede entrar en el hombre y producir gastroenteritis. Su presencia en los hábitats acuáticos le proporciona también la posibilidad de infectar al hombre penetrando a través de las heridas de la piel. Por ello también se desarrolló un modelo de infección por baño en larvas de pez cebra.
En este modelo se utilizaron larvas de pez cebra con 4 días de edad ya que en esta etapa de desarrollo, la boca está abierta y las bacterias pueden entrar por ella y producir una infección que se asemeja a las condiciones naturales de infección de A. hydrophila. Además, se utilizaron también larvas lesionadas con una herida en la punta de la aleta caudal. Esta herida proporciona una ruta de entrada adicional a las bacterias con el fin de reproducir una infección a través de una herida. Los experimentos mostraron una tasa de mortalidad significativamente mayor y una cinética de mortalidad más rápida en larvas lesionadas con respecto a larvas sanas cuando se infectaban con la misma concentración de A. hydrophila. Este resultado confirmó que las heridas del hospedador favorecen la virulencia de esta bacteria. El aumento de la carga bacteriana demostró que A. hydrophila era capaz de producir una infección estable en ambos modelos.
La idoneidad del modelo de infección por baño para estudiar las respuestas inmunitarias desencadenadas por A. hydrophila se evaluó en larvas lesionadas, ya que previamente se había demostrado utilizando larvas sanas. El análisis de la expresión génica mediante PCR cuantitativa reveló mayores niveles de expresión de la il1b y del tnf-a en larvas infectadas, evidenciando que la infección por A. hydrophila amplificaba el estado inflamatorio inducido por la lesión en la cola.
La observación con microscopía confocal de larvas Tg(mpx:GFP) (neutrófilos fluorescentes) mostró un mayor reclutamiento de neutrófilos en la herida de la cola en larvas infectadas, demostrando que la infección de A. hydrophila amplificaba la respuesta inmune. Además, el uso de una cepa fluorescente de A. hydrophila resaltó que las bacterias se adhieren al cuerpo de los peces sólo en los sitios heridos, lo que sugiere que las lesiones cutáneas promueven la adhesion bacteriana a las larvas. Por otra parte, también se observó que los neutrófilos pueden internalizar las bacterias en las heridas. Estos resultados evidenciaron que las lesiones de la aleta caudal promueven la adhesión de A. hydrophila a las larvas, lo que probablemente induce el aumento del reclutamiento de los neutrófilos en la herida y provoca una respuesta inflamatoria muy fuerte que ocasiona la muerte de las larvas.
En conclusión, se han establecido con éxito dos modelos de infección utilizando larvas del pez cebra. La microinyección permite elegir diferentes sitios anatómicos para administrar las bacterias, en particular la inyección en el conducto de Cuvier es un modelo adecuado para estudiar las infecciones sistémicas producidas por A. hydrophila y para caracterizar las respuestas inmunitarias del hospedador provocadas por la infección. Por otro lado, la infección por baño es un modelo válido para reproducir las infecciones orales y de heridas por A. hydrophila. La mayor susceptibilidad de las larvas lesionadas con respecto a las larvas sanas confirma que A. hydrophila aprovecha las heridas para producir enfermedades. La transparencia de las larvas y la disponibilidad de líneas transgénicas que expresan células inmunes fluorescentes y moléculas (por ejemplo, il1b y neutrófilos) permiten obtener imagen a través del cuerpo de larvas enteras y visualizar la respuesta inflamatoria del hospedador. Estos resultados demuestran el alto potencial y la elevada sensibilidad de las larvas del pez cebra para el estudio de la patogénesis de A. hydrophila.
-Capitulo III. Larvas de pez cebra como modelo para estudiar el papel de los factores de virulencia de A. hydrophila en las infecciones orales y a través de heridas.
Una vez establecida la idoneidad de las larvas del pez cebra para establecer infecciones orales y de heridas con A. hydrophila AH-1, éstas se utilizaron para evaluar la importancia de cinco factores de virulencia en estas infecciones. Los factores de virulencias analizados fueron: el sistema de secreción de tipo III (T3SS), los lipopolisacáridos (LPS), la capa S, el flagelo polar y la motilidad.
El sistema de secreción de tipo III (T3SS) es una estructura similar a una aguja y está localizado en la membrana externa de las bacterias Gram negativas. Su función es la de entregar proteínas bacterianas efectoras a través de las membranas del hospedador hasta el citosol y modular una gran variedad de funciones celulares con el fin de favorecer la patogénesis bacteriana. La importancia del T3SS se evaluó mediante el uso de una cepa mutante de A. hydrophila (AH-1::aopB) que presentaba una deleción en el gen que codifica la proteína B (AopB) de la membrana externa implicada en la formación del sistema de secreción de tipo III. Las larvas del pez cebra, sanas y heridas, infectadas por el mutante AH-1::aopB mostraron valores de mortalidad significativamente menores que los registrados en peces infectados con la cepa de tipo salvaje, lo que confirma un papel importante del T3SS en la patogénesis. Además la cinética de mortalidad de larvas lesionadas e infectadas con la cepa mutante AH-1::aopB empezó con un retrasó de 24 horas con respecto a la cinética de la cepa salvaje, lo que sugiere que el T3SS podría estar involucrado en las primeras etapas de la infección de las heridas.
En la parte más externa de la membrana de las bacterias Gram negativas se encuentran los lipopolisacáridos (LPS), que están formados por tres regiones definidas: el lípido A (dominio hidrófobo), el core oligosacárido central y el antígeno O (dominio oligosacárido). Los LPS son una barrera física que protege a las bacterias de las condiciones ambientales adversas, compuestos tóxicos y efectores antimicrobianos del hospedador, por lo tanto los LPS se consideran una estructura de virulencia. Para evaluar la participación de los componentes del LPS en la patogénesis de A. hydrophila, se eligieron dos cepas mutantes de A. hydrophila: el mutante AH-1ΔrmlB que está desprovisto del antígeno O y el mutante AH -1ΔwahD que carece del antígeno O más la parte externa del core oligosacárido.
Los resultados obtenidos mostraron que el mutante AH-1ΔwahD era menos patogénico tanto en infecciones orales como en las heridas, mientras que el mutante AH-1ΔrmlB (que carece del antígeno O) indujo menor tasa de mortalidad solo en larvas lesionadas. Esto evidenció la importancia del antígeno O y principalmente de la porción externa del core oligosacárido en la infección de A. hydrophila.
La capa S es la estructura más externa de las bacterias Gram positivas y Gram negativas y está formada por glicoproteínas organizadas en una capa cristalina bidimensional. La capa S es considerada un factor de virulencia que promueve la resistencia de las bacterias a la muerte sérica y a la fagocitosis, la adhesión, la formación de las biopelículas, la colonización intestinal y la modulación de las respuestas inmunes del hospedador.
Para analizar la implicación de la capa S en la patogénesis de A. hydrophila, se utilizó el mutante AH-1ΔvapA, que carece del gen que codifica la estructura proteica de la capa S. Este mutante resultó ser menos patogénico con respecto a la cepa de tipo salvaje en infecciones de larvas sanas. Considerando que la boca es la ruta principal para la entrada de las bacterias, la baja susceptibilidad de las larvas sanas a la cepa mutante sugiere una posible función de la capa S en la colonización intestinal. Curiosamente, cuando las larvas se lesionaron ofreciendo a las bacterias un portal alternativo de entrada, el mutante AH-1ΔvapA fue tan patogénico como la cepa de tipo salvaje. Este resultado sugiere que la capa S no es totalmente necesaria para A. hydrophila cuando está disponible una ruta abierta para entrar dentro del hospedador.
El flagelo polar y la motilidad son dos factores de virulencia importantes de A. hydrophila ya que están implicados en la adherencia y en la invasión del hospedador. Para analizar su participación en la patogénesis en infecciones orales y de heridas, se generaron dos mutantes: el mutante AH-1ΔFlaB-J carente de flagelo polar y el mutante AH-1::motX sin motilidad (pero provisto de flagelo polar). Estos mutantes no produjeron mortalidad ni en larvas sanas ni en lesionadas, en comparación con los altos niveles de mortalidad obtenidos en peces infectados con la cepa salvaje AH-1. La ausencia del flagelo y de motilidad afectó a la patogenicidad de A. hydrophila muy probablemente porque, teniendo una capacidad de natación reducida, disminuyó la posibilidad de la bacteria de entrar a través de la boca del animal, y la falta del flagelo polar afectó la adherencia a la superficie de los peces para establecer la infección.
Además, la carga bacteriana de larvas lesionadas e infectadas con las tres cepas bacterianas aumentó solamente en aquellas larvas infectadas con la cepa salvaje AH-1 y el mutante AH-1::motX (sin motilidad). Esto sugiere un papel del flagelo en la virulencia de A. hydrophila ya que el mutante AH-1::motX que no produjo mortalidad registró una carga bacteriana similar a la de la cepa salvaje.
La participación de los factores de virulencia en la patogénesis de A. hydrophila también se evaluó en experimentos in vitro midiendo las alteraciones de las poblaciones de las células de riñón del pez cebra adulto y la citotoxicidad en células ZF-4 (línea celular fibroblastica del pez cebra de origen embrionaria) infectadas por los diferentes mutantes. Los resultados de estas infecciones fueron similares para todos los mutantes utilizados: a diferencias de lo que sucede in vivo, en el caso de las infecciones de los cultivos primarios de células de riñón todas las cepas mutantes indujeron una pérdida del perfil de la población celular como el tipo salvaje AH-1, mientras que en el ensayo de citotoxicidad sólo la cepa mutante AH-1::aopB (que carecía del T3SS) indujo un efecto citotóxico reducido similar al del grupo control.
En conclusión, en este capitulo se ha demostrado que las larvas de pez cebra son un modelo adecuado para estudiar el papel de los diferentes factores de virulencia de A. hydrophila en infecciones orales y de heridas. La posibilidad de utilizar un gran número de larvas y la facilidad de realizar las infecciones permite un rastreo de la virulencia utilizando varias cepas mutantes al mismo tiempo.
En particular, destacó que el sistema de secreción de tipo III (T3SS) está implicado en ambos los tipos de infecciones; el core y el antígeno O de los LPS son otras dos estructuras importantes de virulencia, aunque sólo el core es esencial para la virulencia en infección por baño; la capa S es un factor de virulencia necesario en las infecciones por baño, pero no en la infección de heridas, mientras que el flagelo polar y la motilidad son fundamentales en las dos infecciones. Los experimentos in vitro mostraron resultados contrastantes en comparación con los resultados de las infecciones in vivo evidenciando la baja sensibilidad de los ensayos in vitro para analizar el papel específico de los diferentes factores de virulencia de A. hydrophila. Las diferencias entre los modelos in vitro e in vivo de infección podrían ser debidas al contexto tisular que no puede reproducirse in vitro y que obviamente influye en el proceso de infección.
-Capitulo IV. Análisis del perfil del transcriptoma de larvas estimuladas con el flagelo polar de A. hydrophila que contiene diferentes niveles de glicosilación.
Los flagelos de Aeromonas hydrophila son factores de virulencia importantes que están involucrados en la adhesión, invasión y en la formación de biopelículas. En los últimos años se ha descubierto que los flagelos de A. hydrophila están glicosilados con porciones de carbohidratos. El papel de la glicosilación en la virulencia bacteriana no se ha elucidado completamente ya que en algunas especies de bacterias (Burkholderia cenocepacia) la glicosilación de los flagelos aumenta la respuesta inflamatoria del hospedador mientras que en otras especies (Pseudomonas aeruginosa) la glicosilación disminuye la respuesta del hospedador.
En este capítulo se evaluó el papel del flagelo polar y de la motilidad en las infecciones por baño de la cepa gastroenterica Aeromonas hydrophila AH-3 utilizando la cepa wild type y varias cepas mutantes. Además, se analizó el transcriptoma de larvas estimuladas con las estructuras flagelares polares con diferentes niveles de glicosilación con el fin de estudiar la implicación de la glicosilación del flagelo en la respuesta inmune del hospedador.
Las infecciones por baño de larvas lesionadas mostraron que las alteraciones en la motilidad, estructura y glicosilación flagelar inducen una menor mortalidad en comparación con la cepa de tipo salvaje. Se estudió el efecto directo de la flagelina en el sistema inmune del hospedador mediante la inyección en el torrente sanguíneo de los flagelos polares y laterales de A. hydrophila y se evaluó la respuesta inflamatoria a este estímulo. Considerando que los flagelos de A. hydrophila son naturalmente glicosilados, se microinyectaron flagelos que poseían diferentes nivel de glicosilación.
Tanto los flagelos polares y laterales indujeron una alta expresión de il1b. Curiosamente, los flagelos que poseían el grado más alto de glicosilación indujeron la expresión más fuerte de il1b. Por lo tanto, para estudiar en detalle el efecto de la glicosilación sobre la respuesta del hospedador a la flagelina de A. hydrophila, se analizó, mediante microarrays, la respuesta transcriptómica de larvas inyectadas con tres estructuras flagelares polares diversamente glicosiladas (glicosilado, poco glicosilado, no glicosilado).
Los datos mostraron que el nivel de glicosilación de la flagelina influye en el valor promedio de expresión de todos los genes diferencialmente expresados de un modo significativo en el transcriptoma: el flagelo glicosilado indujo la mayor variación en la expresión de los genes del hospedador, evidenciando un efecto directo de la glicosilación en la expresión génica. El análisis de enriquecimiento de los genes modulados (fold change ≥ 1.5) mostró que estos genes pertenecen a las categorías de Gene Ontology (GO) implicadas en la inmunidad y la inflamación. El enriquecimiento de rutas Kegg reveló que esos genes estaban específicamente relacionados con las vías de detección y procesamiento de los antígenos, la liberación de las citoquinas, la señalización inmune y la regulación del ciclo celular. Solamente el grupo estimulado con el flagelo polar glicosilado (Polar G) poseía todas esas categorías GO y rutas de KEGG.
El estudio de la Función Biológica de los genes con un fold change > 3 (genes top 62) indicó que seis de los diez procesos biológicos estaban específicamente relacionados con las respuestas inmunes. Los patrones de estos 62 genes evidenciaron que en cada grupo experimental el nivel de expresión aumentaba con el aumento del grado de glicosilación de la flagelina, de modo que los genes más expresados se encontraban en los grupos de larvas inyectadas con los flagelos glicosilados y poco glicosilados. En particular, la expresión más alta se encontró en el grupo de larvas inyectadas con flagelo completamente glicosilado (Polar G).
En conclusión, en este capítulo se ha evidenciado el papel proinflamatorio de los flagelos polares y laterales A. hydrophila. En particular, se puso de relieve un papel principal de la glicosilación del flagelo polar en la amplificación de la respuesta inmune del hospedador a la flagelina. El análisis mediante microarrays del transcriptoma de las larvas inyectadas con los flagelos polares diferencialmente glicosilados evidenció que la glicosilación es un componente importante pro inflamatorio de los flagelos ya que aumenta la expresión de los genes inmune del hospedador.
El mecanismo biológico por el cual la glicosilación de la flagelina de A. hydrophila aumenta la expresión de los genes inmunes no está claro. Se necesitan más estudios para comprender qué receptores y vías de señalización están involucradas en dicho proceso. Para ello será necesario el análisis de la respuesta inmune a la flagelina después de la inactivación selectiva de algunos genes del hospedador. Las numerosas líneas knockout del pez cebra y la tecnología morfolino, para el silenciamiento transitorio de genes diana, son herramientas útiles que podrían ser utilizados en estos estudios.
