Resumen de Papel regulador de Slingshot-1 en la activación de linfocitos T
Durante la activación del linfocito T, se establece una interacción estrecha con la célula presentadora de antígeno (APC). Esta unión se denomina sinapsis inmunológica (IS) y es necesaria para la correcta activación del linfocito. La formación de la IS implica la polarización de orgánulos celulares y múltiples moléculas de señalización hacia la zona de contacto, donde se reorganizan diferencialmente en anillos concéntricos o SMACs (SupraMolecular Activation Clusters). En la zona más periférica de la IS (distal SMAC, o dSMAC) se acumula la actina, cuya dinámica es esencial no sólo para el ensamblaje de la IS sino también para las funciones efectoras de los linfocitos. La necesidad de una correcta dinámica de actina hace muy interesante el estudio de las proteínas que la regulan. Una de las más importantes es cofilina, que a su vez está activada por la fosfatasa SSH1, cuyo papel durante la activación linfocitaria se desconoce actualmente.
Objetivos El objetivo principal de nuestro trabajo fue investigar el papel de SSH1 durante la migración, activación y formación de la IS de los linfocitos T. Debido a los múltiples mecanismos de regulación de SSH1 sobre cofilina, nos preguntamos además cómo era la respuesta del módulo de señalización de cofilina en función de los niveles de SSH1.
Resultados Mediante experimentos de sobreexpresión de SSH1 o de un mutante de unión a actina (W458A), observamos que existía una respuesta ultrasensible en el módulo de cofilina mediada en parte por la unión de SSH1 a actina. Esta respuesta era además biestable e irreversible con la estimulación antigénica. Realizando experimentos de microscopía confocal, descubrimos que SSH1 era polarizado a las mismas zonas de la IS que actina (dSMAC), lo que también podría contribuir a la ultrasensibilidad del módulo debido al enorme aumento de actividad de SSH1 tras su unión a actina filamentosa. Altos niveles de expresión de un mutante catalítico de SSH1 (C393S) produjeron un aumento en los niveles de F-actina. A través de experimentos de microscopía de TIRF, observamos que la sobreexpresión de este mutante bloqueaba la centralización del TCR y la capacidad de adhesión en tiempos iniciales, fenotipo que atribuimos a la alteración de la dinámica de actina en la IS debido a los altos niveles de F-actina. Estas células además mostraron un defecto en la movilización de calcio a pesar de los mayores niveles de fosforilación de CD3¿ en tiempos tempranos, mientras que las células que sobreexpresaban SSH1 wild type mostraron mayores niveles de activación de CD3¿ y PLC¿1, pero niveles de calcio normales. Además, descubrimos que SSH1 disminuía la velocidad y direccionalidad de las células en migración en microcanales (dos dimensiones), mientras que en matrices de colágeno tridimensionales aumentaba la velocidad y distancia recorrida.
Conclusiones A la vista de nuestros resultados, concluimos que la activación de cofilina es ultrasensible en función de los niveles de SSH1, y que esta respuesta está mediada en parte por la unión de SSH1 a actina. SSH1 además participa en la homeostasis de actina filamentosa y es esencial para el clareamiento de actina en tiempos iniciales de formación de la IS. Los reordenamientos de actina mediados por SSH1 son necesarios para la adhesión celular tras estimulación antigénica y para la centralización inicial del TCR, aunque su perturbación no afectó a la arquitectura de la IS madura. Sin embargo, esta dinámica de actina alterada produjo un defecto en la movilización de calcio tras estimulación del TCR, probablemente debido a la perturbación del cross-talk entre la actina y el aumento de calcio intracelular. Además, encontramos un papel de SSH1 en la direccionalidad de la migración celular en dos dimensiones y en la velocidad y distancia recorrida en tres dimensiones.
