Impact of COX7A2L in the biogenesis of human mitochondrial respiratory chain supercomplexes

• Autores: Teresa Lobo Jarne
• Directores de la Tesis: Cristina Ugalde Bilbao (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2018
• Idioma: inglés
• Número de páginas: 210
• Tribunal Calificador de la Tesis: Rafael Garesse (presid.), Ricardo Escalante Hernández (secret.), Erika María Fernández Vizarra Bailey (voc.), Cristòfol Vives Bauzà (voc.), Juan Pedro Bolaños Hernández (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biociencias Moleculares por la Universidad Autónoma de Madrid
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Proteínas
  • Ciencias de la vida
    • Biología celular
    • Biología molecular
  • Ciencias médicas
    • Ciencias clínicas
      • Patología clínica
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen
  • español

    Los complejos I, III y IV (CI, CIII, CIV) de la cadena respiratoria mitocondrial (CRM) están asociados en estructuras supramoleculares denominadas supercomplejos (SCs) y respirasomas, cuya biogénesis y relevancia tanto funcional como fisiopatológica todavía no están claras. Estas superestructuras originan interdependencias entre los complejos individuales del sistema OXPHOS, lo que conlleva importantes implicaciones para el diagnóstico de las patologías mitocondriales. Ello se debe a que algunos déficits enzimáticos combinados de los complejos de la CRM se pueden atribuir a mutaciones en genes estructurales de un solo complejo. Además, existe un debate intenso y controvertido sobre el papel de la proteína mitocondrial COX7A2L / COX7RP / SCAFI en la función y biogénesis de los SCs. Para dilucidar el papel de COX7A2L en la organización estructural de la CRM en humanos, se realizaron análisis bioquímicos y proteómicos sobre cíbridos transmitocondriales control y mutantes carentes de uno de los complejos de la CRM, así como ensayos de silenciamiento del ARN mensajero de COX7A2L. Los resultados demostraron que COX7A2L se une principalmente al dímero del complejo III (CIII2) y en menor medida al CIV, para promover específicamente la estabilización del SC III2+IV sin afectar a la formación del respirasoma. El estudio se extendió a células HEK293T carentes de COX7A2L (COX7A2L-KO), creadas en el laboratorio mediante la tecnología TALEN. La ausencia de COX7A2L impide la formación del SC III2+IV sin afectar a la biogénesis de novo del CIV; además, promueve un aumento tanto en la cinética de ensamblaje como en los niveles estacionarios del CIII2, al tiempo que retrasa la formación de los SCs que contienen al CIII (que no obstante, alcanzan los niveles estacionarios del control). Ensayos funcionales de competición de sustratos revelaron que en las células COX7A2L-KO aumenta significativamente el flujo de electrones desde el CII al CIII2 al inducir un déficit parcial en la actividad del CI. En conclusión, COX7A2L establecería un punto de control de la biogénesis del CIII2 y de los SCs que contienen al CIII, lo cual limitaría la oxidación del succinato cuando la actividad enzimática del CI está disminuida. Asimismo, estos datos muestran la coexistencia de mecanismos reguladores independientes en la biogénesis del SC III2+IV y de los respirasomas.

    La función principal de COX7A2L sobre la biogénesis del CIII se confirmó mediante análisis del ensamblaje y composición de los SCs en cíbridos humanos control y mutantes sin CIV debido a mutaciones patogénicas en las subunidades COX1 y COX2. En ausencia del CIV, se identificaron tres bandas correspondientes a diferentes especies del SC I+III2 que también contienen a COX7A2L; de ellas, dos bandas mostraron la presencia de subunidades COX específicas del ensamblaje tardío del CIV. Este trabajo demuestra que la formación del SC I+III2 ocurre antes de la asociación gradual de las subunidades del CIV, las cuales son esenciales para estabilizar dicha estructura y revela la existencia de líneas de ensamblaje alternativas para la síntesis del CIV en su forma individual o asociada a los SCs.

  • English

    Mitochondrial respiratory chain (MRC) complexes I, III and IV are associated in large supramolecular structures termed supercomplexes (SCs) and respirasomes, whose biogenesis and functional and pathophysiological relevance remain unclear. Such superstructures originate interdependences between the individual OXPHOS complexes, with major biomedical implications for the diagnosis of mitochondrial disorders because combined deficiencies of these complexes can be attributed to a genetic defect of a single MRC complex. Furthermore, the functional implication of the mitochondrial protein COX7A2L / COX7RP / SCAFI in the biogenesis of SCs is a subject of intense and controversial debate. To elucidate the role of COX7A2L in the structural organization of human MRC, blue native electrophoresis, proteomic analyses and COX7A2L downregulation assays were performed in control and mutant transmitochondrial cybrids lacking one of each MRC complexes. Our results showed that human COX7A2L binds primarily to the SC-unbound complex III dimer (CIII2) and to a minor extent to free complex IV, to specifically promote the stabilization of the SC III2+IV without affecting the respirasomes formation. Further analyses in TALEN-mediated COX7A2L knockout (COX7A2L-KO) HEK293T cells demonstrated that the lack of COX7A2L prevents SC III2+IV formation without affecting de novo complex IV biogenesis, enhances the biogenetic rates of CIII2, and delays the formation of the complex III-containing respirasomes that, nonetheless, accumulate to control steady-state levels. Functional substrate competition assays revealed that, upon the induction of complex I deficiency, COX7A2L-KO cells significantly favour electron flux through complex II. Altogether, our data suggest that COX7A2L establishes a regulatory checkpoint for the biogenesis of CIII2 and complex III-containing SCs that limits succinate oxidation when complex I activity is compromised, and that independent regulatory mechanisms co-exist for the biogenesis of SC III2+IV and the respirasomes.

    The primary role of COX7A2L in the biogenesis of complex III-related MRC structures was confirmed through comparative analyses of the assembly and composition of human SCs between control cells and two mutant cybrids lacking complex IV due to pathogenic nonsense mutations in the COX1 and COX2 subunits, respectively. In the absence of complex IV, three different bands corresponding to fully-assembled SC I+III2 were identified, which also contained COX7A2L. Surprisingly, two of these SC I+III2 bands showed the presence of specific complex IV subunits that regularly take part in late steps of complex IV assembly. Reversible inhibition of mitochondrial translation demonstrated that the biogenesis of COX7A2L-containing SC I+III2 is completed prior to the stepwise association of complex IV subunits. Radioactive pulse-chase analyses additionally showed that the insertion of COX subunits is essential to stabilize the COX7A2L-containing SC I+III2. Our results thus reveal the existence of alternative COX assembly lines for the synthesis of free- versus SC-associated complex IV.