Modulation of intestinal immune response by Outer Membrane Vesicles from probiotic and commensal Escherichia coli strains
- Autores: Maria José Fábrega Fernández
- Directores de la Tesis: Laura Baldoma (dir. tes.), Rosa Giménez Claudio (codir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2018
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco José Pérez Cano (presid.), Margarita Martínez Medina (secret.), Natividad Garrido Mesa (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biotecnología por la Universidad de Barcelona
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Dipòsit Digital de la UB TDX
- Resumen
El tracto gastrointestinal humano es uno de los ecosistemas microbianos más densamente poblados. Es por ello por lo que el sistema inmunitario intestinal está constantemente expuesto a altas concentraciones de antígenos microbianos y alimentarios. La relación simbiótica entre la microbiota intestinal y el huésped es altamente compleja, pero esencial para mantener un correcto balance entre el estado de salud y enfermedad. Estudios realizados con animales “germfree” han demostrado que la microbiota intestinal es esencial para la correcta maduración y funcionalidad de la barrera intestinal y el sistema inmunitario asociado. Paradójicamente, la microbiota comensal es también una fuente amplia de material antigénico, el cual está desafiando constantemente la inmunidad innata intestinal, manteniendo un estado constante de estimulación del sistema inmunitario. En individuos sanos, la inmunidad innata es capaz de mantener un balance homeostático multifacético, presentando una baja respuesta frente a la microbiota comensal, pero manteniendo la capacidad de reaccionar frente a un ataque por patógenos. Una de las principales líneas de defensa en la homeostasis intestinal es la barrera epitelial intestinal, la cual actúa tanto como barrera física, como colaborador del sistema inmunitario proporcionando la captación de componentes bacterianos. El epitelio intestinal está cubierto por una capa de mucus que forma una cubierta protectora sobre las células epiteliales, las cuales quedan protegidas de daños enzimáticos, químicos o mecánicos. Además, evita el contacto directo de bacterias con el epitelio. Por lo tanto, la compleja comunicación entre la microbiota y las células epiteliales intestinales es mediada a través de factores bacterianos solubles que pueden difundir a través de la capa de mucus y llegar al epitelio. Dentro de estos factores, las bacterias liberan compuestos solubles y vesículas extracelulares. Las vesículas liberadas por bacterias Gram negativas se denominan vesículas de membrana externa (OMVs). Las OMVs representan un mecanismo de liberación a distancia de compuestos bacterianos, protegiendo dichos compuestos de daños externos. Estos compuestos incluidos dentro de las vesículas son capaces de llegar a las células epiteliales y activar diferentes vías de señalización. Como consecuencia, las vesículas liberadas por la microbiota intestinal podrían ser consideradas como factores claves en la comunicación microbiota-epitelio. Al comienzo de esta tesis, solo dos aportaciones científicas estaban relacionadas con esta línea de trabajo. Por lo tanto, la investigación de nuestro grupo tuvo como objetivo estudiar el papel de las vesículas liberadas por la microbiota como moduladores de la homeostasis intestinal, especialmente aquellos relacionados con la respuesta inmunitaria y función de barrera.
La microbiota intestinal humana está formada por una amplia comunidad microbiana comensal. Dentro de todas estas bacterias, algunas cepas presentan propiedades probióticas que proporcionan un beneficio para el huésped. La disbiosis intestinal ha sido asociada con múltiples enfermedades, y la administración de probióticos se ha contemplado como una nueva estrategia terapéutica para modular y restablecer la composición de la microbiota.
En este trabajo, hemos centrado nuestra atención en estudiar las bacterias Gram negativas, en concreto la cepa probiótica Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) y la cepa comensal ECOR12 (E. coli intestinal aislada de un individuo sano). El objetivo de este proyecto fue evaluar la actividad inmunomoduladora de las vesículas extracelulares (OMVs) liberadas por estas cepas de microbiota intestinal. Muchos estudios han demostrado el efecto antiinflamatorio beneficioso de la cepa EcN en la remisión de la colitis ulcerosa. Sin embargo, el papel de las vesículas liberadas por este probiótico era desconocido hasta la fecha. Por ello, como primer objetivo (capítulo 1) propuesto para este estudio fue analizar el potencial de las OMVs liberadas por las cepas EcN y ECOR12 de modular la respuesta inmunitaria, usando diferentes modelos celulares in vitro de barrera intestinal y explantes de colon humano, como modelo ex vivo. El análisis de expresión génica y cuantificación de proteína de diferentes citoquinas y mediadores inmunitarios (citoquinas proinflamatorias, antiinflamatorias y quimioquinas) confirmaron esta hipótesis. Ambos tipos de vesículas fueron capaces de regular el balance de citoquinas y, específicamente las OMVs de EcN mostraron un mejor perfil antiinflamatorio. Por ello, el siguiente objetivo fue comprobar si las OMVs aisladas de EcN eran capaces de, en ausencia de bacterias vivas, mejorar los síntomas asociados a la colitis (capítulo 2). Para estudiar esta hipótesis, se utilizó un modelo in vivo de colitis experimental, inducida por DSS, en ratones. Los resultados demostraron que la administración de vesículas de EcN mejoraron el estado de salud y el daño histológico asociado al DSS. Además, el tratamiento con OMVs contrarrestó la expresión alterada de citoquinas y otros marcadores bioquímicos relacionados con la inflamación y la función de barrera intestinal. Este estudio demostró, por primera vez, que las vesículas de EcN median efectos antiinflamatorios, los cuales ya fueron previamente demostrados mediante ensayos in vivo realizados con la bacteria probiótica. Esta contribución indica que las OMVs liberadas por EcN van ligadas al efecto probiótico de la bacteria y, además, evidenciamos que vesículas de microbiota y probióticos tienen un papel importante en la comunicación microbiota-huésped.
Por otro lado, la investigación desarrollada por nuestro grupo demostró que las vesículas secretadas por ECOR12 y EcN son internalizadas en células epiteliales mediante endocitosis mediada por clatrina, y son posteriormente redirigidas hasta compartimentos endosómicos. Está descrito que las vesículas de cepas patógenas que son internalizadas interaccionan a través del peptidoglicano con receptores citosólicos tipo NOD, los cuales son reclutados a la membrana de los endosomas, y activan la vía de señalización dependiente de NOD, cuya cascada dirige a la activación del factor de transcripción NF-κB. En este contexto, analizamos si la respuesta inmunomoduladora inducida por vesículas de EcN y ECOR12 dependía de receptores NOD. Para alcanzar este tercer objetivo (capítulo 3), se siguieron dos estrategias experimentales: (i) silenciamiento de células epiteliales intestinales con específicos RNAs de interferencia (siRNAs), dirigidos contra receptores NOD1 y NOD2; y (ii) bloque de proteínas clave implicadas en la vía de señalización de NOD, usando un inhibidor de la quinasa RIP2, la cual desencadena la cascada de fosforilación que resulta en la activación del NF-κB y la translocación hacia el núcleo. En estas células, la respuesta inflamatoria inducida por OMVs fue evaluada mediante la activación de NF-κB, y mediante la expresión de citoquinas IL-8 e IL-6. Además, empleando microscopía confocal de fluorescencia, se demostró la co-localización (interacción) de NOD1 con vesículas bacterianas y el reclutamiento de NOD1 hacia endosomas tempranos, desencadenado por OMVs. En general, los resultados indicaron que tanto las vesículas de EcN como de ECOR12 activan NOD1, pero no NOD2, si bien el tiempo necesario para dicha activación es diferente entre ambos tipos vesiculares. Las OMVs de EcN desencadenaron la agregación de NOD1 (20 minutos) y la degradación de IκBα (60 minutos) antes que las OMVs de ECOR12. Esta es la primera vez que se describe la activación intracelular de receptores NOD1 por vesículas derivadas de microbiota intestinal, confirmando así el papel de estas vesículas como mediadores clave de los efectos de la microbiota en la homeostasis intestinal.
Finalmente, en base a los efectos inhibitorios de los sobrenadantes de EcN frente a infecciones causadas por patógenos entéricos como Salmonella, nos planteamos explorar si este efecto podría ser debido a la liberación de OMVs (capítulo 4). Esta parte experimental de la tesis fue comenzada y llevada a cabo durante una estancia en el laboratorio de la Dra. Ana Eulalio (Universidad de Würzburg), un grupo puntero en el estudio de la regulación de miRNAs del huésped por patógenos bacterianos invasivos. El proyecto fue continuado en el laboratorio de la Universidad de Barcelona. Los resultados demostraron que EcN reduce en un 50% la invasión de Salmonella, pero que este efecto no es mediado por OMVs, sino por otros factores solubles secretados. La naturaleza de estos factores activos es todavía desconocida, pero sí sabemos que no es una proteína, ni una molécula de DNA o RNA. Con respecto al mecanismo de acción de estos factores liberados por EcN, nuestros resultados excluyeron una inhibición de la adhesión de Salmonella o de la replicación intracelular. Sin embargo, sí que nos sugieren que estos efectores secretados probablemente estarían actuando interfiriendo con la secreción de factores de virulencia a través del T3SS de Salmonella y la liberación de estos mismos hacia la célula huésped infectada. Sorprendentemente, este efecto no es específico de cepa, si no que otras cepas de E. coli mostraron la misma actividad inhibitoria sobre la infección de Salmonella.
En conclusión, los datos presentados en esta tesis muestran que las OMVs liberadas por cepas E. coli de la microbiota, tienen un papel clave en la modulación de la respuesta inmune del huésped, con una prominente activación de la señalización a través de NOD1. Además, las OMVs liberadas por este probiótico podrían ser las responsables de muchos de los efectos atribuidos al probiótico en sí, en concreto, los efectos antiinflamatorios observados en el modelo experimental de colitis in vivo. Sin embargo, las OMVs no contribuyen al efecto inhibitorio mediado por EcN frente a la invasión por Salmonella, siendo este efecto mediado por factores solubles secretados. Esta observación demuestra que las vesículas podrían actuar como “comunicasomas” relevantes en la comunicación entre el huésped y la microbiota, controlando parámetros clave de la homeostasis intestinal, lo cual incluye la defensa frente a daños externos (inflamación o patógenos), pero también el desarrollo de la tolerancia del huésped frente a la microbiota comensal.
