ARNs no codificants petits en Limfoma de Hodgkin: regulació epigenètica de micro RNAs i importància de la via PIWI/piRNA
- Autores: Anna Cordero Santanach
- Directores de la Tesis: Mariano Monzo Planella (dir. tes.), Alfons Navarro Ponz (codir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2016
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: José Ramírez (presid.), Beatriz Bellosillo Paricio (secret.), Antonio Salar Silvestre (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Medicina e Investigación Traslacional por la Universidad de Barcelona
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TESEO Dipòsit Digital de la UB TDX
- Resumen
El Linfoma de Hodgkin (LH) es un linfoma de origen B que se caracteriza por contener muy pocas células tumorales (<1%) rodeadas de un microambiente reactivo. Durante los últimos años los ARNs pequeños no codificantes han emergido como prometedores marcadores moleculares en múltiples tipos de cáncer, incluyendo el LH.
Los microRNAs (miRNAs) son moléculas de ARN de 19 a 25 nucleótidos no codificantes, cuya función principal es inhibir la traducción a proteína. Algunos de ellos son susceptibles a ser reguladors por metilación, de manera que cuando están metilados no se expresan. Después de tratar con un agente desmetilante, el 5-Aza-dC, las línieas celulares L-428 y L-1236, realizamos un perfil de expresión de miRNAs. Vimos que en la L-428 se reexpresavan 56 miRNAs y en la L-1236, 37. De estos seleccionamos los 13 comunes para proceder con el estudio. De todos ellos solo seis eran suceptibles a ser regulados por metilación ya que contenían en su secuencia islas CpG. Se realizaron PCR específicas de metilación para validar los resultados de los arrays en las dos líneas anteriores y en la HDMYZ y la L-540, además de en cé•lulas B de sangre periférica usadas como control. En las líneas celulares el MIR34A, MIR203, MIR490 y MIR375 estaban metilados y el clúster MIR512-525 estaba metilado/desmetilado (principalmente metilado) en la L-428 y L-1236. El MIR342 estaba metilado en la L-1236 pero no en la L-428. De los 13 miRNAs estudiados, solo el MIR203, MIR375 y MIR512-525 estaban metilados en les cuatro líneas celulares estudiadas. En los ganglios de pacientes, el MIR34A i MIR203, conocidos supresores tumorales en tumores sólidos, se encuentran metilados en núcleo de las celular HRS i desmetilados en el microambiente. Después de realizar el tratamiento con el agente desmetilante, hemos visto que hay una reducción de la proliferación dosidependiente de 5-Aza-dC en les líneas L-428, L-1236, HD-MY-Z y L-540. La mayor reducción de la proliferación se obtuvo con la dosis máxima de 5-Aza-dC: 20% en la L-428, 34% en la L-1236, 28% en la HD-MY-Z y un 24% en la L-540. De forma interesante, el miR-34a y el miR-203 tenían una reexpressión preferencial a dosis bajas o intermedias de fármaco.
También hemos estudiado la implicación de la vía PIWI/piRNA en el LHc. Hasta hace relativamente pocos años, se pensava que esta vía estaba solo activa durante en desarrollo embrionario y en las células germinales. Su función principal es la de mantener la estabilidad genómica, entre otras funciones regulando los transposones y la metilación del ADN. Ahora se sabe que esta vía puede estar activa en tejidos adultos y durante los procesos oncogénicos. En este estudio nos hemos centrado en determinar si los componentes de la vía PIWI/piRNA (las proteínas PIWI i los piwiRNAs (piRNAs)) están activos en el LH y si pueden ejercer un papel pronóstico. En las líneas celulares utilizadas (L-428, L-1236, HDLM2 y L-540) hemos observado que todas expresan PIWIL1, 2 y 4. PIWIL1 tiene niveles muy bajos de mensajero respteto a PIWIL2 y PIWIL4. Al comparar su expresión con la de las células B sanguíneas, utilizadas como control endógeno, hemos visto que PIWIL1 no se expresa y que PIWIL2 y PIWIL4 están infraexpredasas respeto a las células B. Por Western Blot pudimos comprovar que también hay expresión a nivel de proteína y que estos niveles varian en función de la línea celular. A continuación, observamos mediante imunohistiquímica que PIWIL1, PIWIL2 y PIWIL4 se expresan en el citoplasma de las células de Hodgkin y Reed-Sternberg. Mientras que PIWIL1 y 4 solo se expresan en algunas de las muestras, PIWIL2 lo expresan todos los pacientes y también se detecta expresión en células del microambiente reactivo. A continuación, estudiamos la expresión de tres piRNAs previamente descritos en la literatura por su papel como oncogenes en tumores sólidos. El piR-651, el piR-20365 y el piR-20582 se expresan tanto en las líneas celulares como en los ganglios linfáticos. Los tres piRNAs estaban sobreexpresados en los ganglios de pacientes respeto a los ganglios reactivos control. El único de los tres que presentaba papel pronóstico era el piR-651. Para comprobar que su expresión procedía del tumor, realizamos una hibridación in situ que nos permitió ver que había una fuerte expresión de piR-651 en el citoplasma de las células HRS. Los pacientes con niveles más altos del piR-651 presentaban una supervivencia global y libre de enfermedad más cortas. Luego evaluamos la expresión del piR-651 en sérum de pacientes en el momento del diagnóstico y al alcanzar la respuesta completa. En el momento del diagnóstico los niveles de piR-651 estaban más bajos respeto a los controles sanos, pero una vez finalizado el tratamiento recuperaban los niveles de los controles sanos.
