Resumen de New insights in the study of boar semen cryopreservation
- español
El objetivo principal fue mejorar el conocimiento actual de la criopreservación espermática en porcino. Se propusieron tres objetivos concretos: (1) Determinar el papel de los antioxidantes del plasma seminal (PS) en la congelabilidad espermática (exp. 1); (2) evaluar si el PS de la fracción post-espermática es el único responsable de que los espermatozoides del eyaculado completo congelen peor que los de la fracción rica en espermatozoides (FR) (exp. 2); y (3) analizar si el tiempo de conservación en nitrógeno líquido (NL) de las dosis de semen congeladas influye en la calidad espermática a la descongelación (exp. 3).
En el exp. 1, se utilizaron diez eyaculados recogidos manualmente en fracciones: los 10 primeros ml de la FR (P1), el resto de la FR (P2) y la post-FR. Los espermatozoides de una parte de cada fracción fueron criopreservados utilizando un protocolo estándar para pajuelas de 0,5 ml. El resto fue utilizado para recoger el PS. Los espermatozoides de P1 y P2 mostraron mejor motilidad y viabilidad que los de la post-FR (P<0,01) a la descongelación. Mientras que los espermatozoides viables de P1 y P2 generaron menos sustancias oxígenos reactivas y experimentaron menos peroxidación lipídica (LPO) que los de post-FR (P<0,01). El análisis de regresión indicó que la superóxido dismutasa (SOD), la capacidad antioxidante equivalente de Trolox (TEAC) y la de reducción férrica del plasma tenían un buen valor predictivo para la motilidad a la descongelación (R2 = 54,8 %, P < 0,001), y la SOD, paraoxonasa 1, glutatión peroxidasa 5 y TEAC para la viabilidad (R2 = 54,8 %, P < 0,001). Estos resultados demostraban claramente que los antioxidantes del PS están implicados en la congelabilidad de los espermatozoides de porcino.
En el exp. 2, doce eyaculados fueron manualmente recogidos también en fracciones. Las muestras fueron centrifugadas para separar los espermatozoides del PS. Los espermatozoides de P1 y P2 fueron rediluidos bien un su propio PS o en PS de la post-FR, conservados a 17º durante 12-16 h y seguidamente congelados. La conservación en PS de la post-FR perjudicó (P<0,05) la motilidad, independientemente de si procedían de P1 o P2. El origen del semen perjudicó la viabilidad, independientemente del PS utilizado en la conservación (peor en P2 que en P1; P<0,05). A la descongelación, el PS no influyó, pero sí el origen de los espermatozoides; los de P1 mostraron mejor motilidad y menor LPO que los de P2 (P<0,05). El perfil proteico de los espermatozoides fue analizado con 2D-PAGE mostrando diferencias entre los de P1 y P2. Estos resultados evidencian que el PS de post-FR no es perjudicial para la congelabilidad de los espermatozoides de porcino y sugieren que el proteoma de los espermatozoides podría explicar las diferencias en congelabilidad espermática entre fracciones del eyaculado.
En el exp. 3, la motilidad, incluidos los parámetros de cinética, y la viabilidad espermática pos-descongelación se evaluaron en 58 muestras conservadas en NL durante 8 años. Las valoraciones se realizaron a los 2, 4 y 8 años de conservación, y se compararon con las realizadas a los 15 d después de la congelación (control). La viabilidad no estuvo afectada por el tiempo de conservación, pero si la motilidad total y progresiva, que fueron menores (P<0,01) en las muestras conservadas 4 y 8 años. Los parámetros de cinética diferían entre los controles y las muestras conservadas 2 y 4 años (P<0,01). Estos resultados demuestran que conservar el semen congelado de porcino en nitrógeno líquido más de 2 años puede perjudicar la motilidad espermática a la descongelación.
- English
The PhD Thesis aimed to improve the current knowledge of boar sperm cryopreservation. To achieve it, three specific objectives were proposed: (1) to address the role of antioxidants of seminal plasma (SP) in protecting boar sperm against cryopreservation stress (exp. 1); (2) to evaluate whether SP from post-sperm rich ejaculate fraction (post-SRF) is the only reason why sperm from the entire ejaculate cryopreserve worse than those from the SRF (exp. 2); and (3) to evaluate whether cryostorage time of boar frozen semen doses in liquid nitrogen (LN2) tanks affects the further post-thaw sperm quality (exp. 3).
In exp. 1, ten ejaculates were manually collected in fractions: the first 10 mL of SRF (P1), the rest of the SRF (P2) and the post-SRF. A portion of each fraction was used for sperm cryopreservation (using a standard protocol for 0.5 mL straws) while the rest was used to collect SP for antioxidant assessment. Frozen-thawed (FT) sperm from the SRF (P1 and P2) showed higher motility and viability than those from post-SRF (P<0.01). Viable FT-sperm from SRF generated less intracellular reactive oxygen species and experienced less lipid peroxidation (LPO) than those from the post-SRF (P<0.01). Regression analyses indicated that some SP-antioxidants influenced sperm freezability. Specifically, superoxide dismutase (SOD), trolox-equivalent antioxidant capacity (TEAC) and ferric-reducing ability showed good predictive value for post-thaw recovery rates of total motility (R2 = 54.8%, P < 0.001), whereas SOD, paraoxonase 1, glutathione peroxidase 5 and TEAC for post-thaw recovery rates of viability (R2 = 56.1%, P < 0.001). These results demonstrated that SP-antioxidant are directly involved in boar sperm freezability.
In experiment 2, twelve ejaculates were manually collected in fractions: P1, P2 and post-SRF. Samples were centrifuged to separate sperm and SP. Sperm from P1 and P2 were re-diluted with either its own SP or SP from post-SRF, then overnight storage at 17 ºC and frozen the next day. After overnight storage, sperm motility was impaired (P < 0.05) in both P1 and P2 when diluted with SP from post-SRF. In contrast, sperm viability was higher (P < 0.05) in P1 than in P2, regardless of the SP used during overnight storage. After thawing, sperm quality and functionality were affected by sperm origin, regardless of the SP used during pre-freezing storage. Sperm from P1 showed highest (P < 0.05) motility and viability and lowest (P<0.05) plasma membrane fluidity and LPO. Protein profile of sperm from P1 and P2 was analyzed by 2D-PAGE, showing qualitatively differences among them. These results highlighted that SP from post-SRF is not detrimental for boar sperm freezability and also suggested that differences in sperm proteome could explain the differences between ejaculate fractions in sperm freezability.
In experiment 3, post-thaw sperm motility, including kinetics, and viability was evaluated in 58 semen samples cryostored in LN2 for up to 8 yr. Post-thaw sperm quality was evaluated after 2, 4 or 8 yr of cryostorage, and values were compared to those obtained in straws of the same semen samples thawed few days after freezing (15 d). Sperm viability was not affected by cryostorage length, but total and progressive sperm motility were lower (P < 0.01) in semen samples cryostored for 4 or 8 yr than in those thawed 15 d after freezing. Cryostorage time also affected sperm kinetics, with greater intensity in the samples cryostored for 4 yr (p < 0.001) than in those for 2 yr (P < 0.01). These results demonstrated that more than to 2 yrs of cryostorage time negatively influences the quality of FT-boar sperm samples.
