Estudio de las poblaciones de pequeños RNAs derivados de virus de plantas y su possible función como moléculas reguladoras en la interacción planta-virus

• Autores: Livia Donaire Segarra
• Directores de la Tesis: César Llave Correas (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Politécnica de Madrid ( España ) en 2011
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Fernando García Arenal (presid.), Eduardo R. Bejarano (secret.), Javier Romero Cano (voc.), Vicente Pallás Benet (voc.), Juan Antonio García Álvarez (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Virología
  • Ciencias agrarias
    • Fitopatología
      • Virus
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Digital CSIC
• Resumen

  • En los organismos eucariotas, el silenciamiento por RNA es un mecanismo de regulación que controla la expresión génica y la estabilidad genómica a través de la síntesis de pequeños RNAs (sRNAs) a partir de inductores de doble cadena de RNA (dsRNA). Estos sRNAs, de 20 a 25 nucleótidos (nts), se unen a complejos multienzimáticos y les confieren la facultad de reconocer y silenciar transcripcional o post-transcripcionalmente secuencias de DNA o RNA altamente complementarias. En el tejido vegetal infectado con virus, este proceso se activa de forma natural mediante la formación de dsRNAs de origen viral. Como resultado, la infección está inexorablemente unida a la síntesis de sRNAs virales (vsRNAs) cuyo potencial regulador se asocia no sólo con la función del silenciamiento por RNA como mecanismo de defensa antiviral sino también con fenómenos como la patogénesis o el rango de hospedador. En esta tesis doctoral hemos empleado distintas técnicas de secuenciación e hibridación molecular en el sistema modelo Virus del cascabeleo del tabaco (Tobacco rattle virus, TRV)-Arabidopsis thaliana y en otros sistemas planta-virus para inferir la composición y estructura de las poblaciones de vsRNAs que se forman en el tejido infectado. Hemos investigado los componentes genéticos y los requerimientos estructurales de la maquinaria de silenciamiento de RNA de la planta para producir vsRNAs. Finalmente hemos analizado el papel del silenciamiento como componente antiviral en la planta y su potencial para reprogramar el transcriptoma de la célula infectada a través de la interacción funcional entre vsRNAs y RNAs mensajeros (mRNAs).

    Nuestros resultados revelan que los vsRNAs forman poblaciones abundantes y diversas en su composición que comparten características comunes en todos los sistemas planta-virus investigados. Así los vsRNAs muestran un sesgo evidente en su tamaño (con mayoría de especies de 21 y 22 nts) y, con frecuencia, en su polaridad (predominio de secuencias positivas). Otra característica común es la ubicuidad de los vsRNAs en su origen a partir del genoma viral. Los vsRNAs se generan en cualquier posición a lo largo del RNA viral aunque su distribución es muy heterogénea alternándose regiones genómicas pobres en secuencias con otras más enriquecidas en vsRNAs en forma de picos de acumulación o de regiones más amplias con alta densidad de secuencias.

    Nuestro trabajo demuestra que las RNasas tipo III Dicer-like, DCL4, DCL3 y DCL2, procesan, solas o combinadas unas con otras, las dsRNAs virales para producir vsRNAs de ambas polaridades a lo largo de todo el genoma de TRV. No obstante, las tres enzimas DCL cortan sustratos virales de forma jerárquica (DCL4>DCL2>DCL3) produciendo vsRNAs de 21, 22 y 24 nts, respectivamente. Nuestros datos sugieren que estas enzimas actúan sobre dsRNAs inductores en forma de intermediarios replicativos o plegamientos imperfectos del RNA viral para generar vsRNAs primarios. Sin embargo, nuestros resultados confirman que la mayoría de los vsRNAs en el tejido infectado son secundarios y resultan de la actividad de DCL sobre dsRNAs que se originan por la actividad de proteínas RNA polimerasas dependientes de RNA de la planta (RDR). Estas enzimas amplificarían las respuestas iniciales de silenciamiento convirtiendo el RNA viral en dsRNAs.

    El análisis de las colecciones secuenciadas sugiere que los vsRNAs tienen afinidad por diversas proteínas ARGONAUTA (AGO) que actúan como efectoras de silenciamiento sobre moléculas diana de RNA o DNA. Esto indica que los vsRNA podrían mediar en distintas rutas reguladoras que controlasen la expresión de genes del virus y del huésped. Nuestros datos confirman el papel de distintos componentes de la maquinaria de silenciamiento en inmunidad antiviral puesto que la desactivación genética de DCL4 y DCL2 o de RDR1, RDR2 y RDR6 resulta en un fenotipo de híper-susceptibilidad a TRV. Este fenómeno no se asocia al procesamiento de dsRNAs virales por DCL sino muy probablemente a la actividad de los vsRNAs generados a partir de las dsRNAs. Empleando técnicas informáticas hemos identificado genes de arabidopsis con alto grado de complementariedad con vsRNAs y que podrían servir como posibles dianas de regulación negativa durante la infección viral.