Resumen de Desarrollo de métodos de pcr convencional para la detección de mohos productores de micotoxinas en alimentos
En la superficie de alimentos, se desarrolla una abundante población de mohos entre los que predominan especies pertenecientes a los géneros Penicillium y Aspergillus. Estas y otras especies de mohos producen metabolitos secundarios, como las aflatoxinas, ocratoxina A y patulina. Estas micotoxinas tienen propiedades toxigénicas, teratogénicas y carcinógenicas. Para evitar la presencia de los mohos productores de estas micotoxinas en alimentos es necesario contar con métodos que permitan detectar cepas productoras.
La detección de mohos potencialmente toxigénicos puede realizarse utilizando métodos convencionales de aislamiento, cultivo del moho y evaluación de la producción de la micotoxina. Este procedimiento es laborioso y consume mucho tiempo de análisis, por lo que dificulta su uso como técnica rutinaria de análisis. Una alternativa a este tipo de métodos es el diseño de protocolos de PCR que permitan la detección de los mohos productores de aflatoxinas, OTA y patulina por individual y simultáneamente. Para el diseño de este tipo de métodos hay que tener en cuenta que se conocen los enzimas que intervienen en la biosíntesis y los genes que codifican a las aflatoxinas, OTA y patulina, pero únicamente han sido estudiadas las dos especies de mayor potencial aflatoxigénico en el caso de las aflatoxinas y las especies mayormente conocidas de Penicillium, en el caso de OTA y patulina, por lo que deben abordarse diferentes protocolos de PCR ensayando con las secuencias relacionadas con la síntesis de las mismas, capaces de detectar mohos potencialmente toxigénicos pertenecientes a diversos géneros. El objetivo de este trabajo fue encontrar secuencias relacionadas con la síntesis de aflatoxinas, OTA y patulina a partir de las cuales desarrollar métodos de PCR para la detección específica de mohos productores de estas micotoxinas pertenecientes a los distintos géneros. Para el desarrollo de este trabajo se han utilizado 64 cepas pertenecientes a diferentes Colecciones de Cultivos Tipo y diferentes aislados de mohos procedentes de productos cárnicos madurados. Se ha evaluado la producción de aflatoxinas, OTA y Patulina de estas cepas y de los aislados en agar extracto de malta (cepas productoras de patulina) y en PDA (cepas aflatoxigénicas y ocratoxigénicas) utilizando los métodos cualitativos TLC, MECC y HPLC-MS. La técnica de TLC no permite la detección sensible de las cepas productoras. Mediante MECC y HPLC-MS se confirmó la producción de aflatoxinas, OTA y patulina en gran parte de las cepas consideradas como productoras y en otras de las cepas en las que no se disponía de información en la correspondiente colección de cultivo. Todas las cepas que produjeron aflatoxinas, OTA ó patulina, respectivamente, fueron consideradas como productoras y, previamente confirmadas mediante cada uno de los métodos de PCR desarrollados con cebadores específicos diseñados, para la detección de mohos productores de estas micotoxinas. Utilizando cepas de la colección al azar, confirmadas previamente por técnicas analíticas como productoras, se desarrollaron varios protocolos de PCR para la detección de mohos productores de aflatoxinas, OTA y patulina, de manera individual, y posteriormente, se desarrolló un método de PCR múltiple para la detección simultánea de mohos productores de estas micotoxinas. Estos protocolos fueron ensayados tanto con ADN genómico como con ADN de mohos extraído directamente, sin necesidad de previa incubación, de alimentos contaminados.
Para la detección de mohos aflatoxigénicos, se abordó el análisis de secuencias conocidas de genes que regulan la síntesis de estas micotoxinas (aflR, C2, nor-1, APA, ver-1 y omt-1). Para la detección de mohos ocratoxigénicos, se probaron secuencias de los genes otapksPN y otanpsPN y, para la detección de mohos productores de patulina, secuencias de genes que regulan la síntesis de la patulina (PEF, idh e iao).
De todas las vías probadas, los métodos de PCR llevados a cabo con secuencias de cebadores basados en los genes omt-1, otanpsPN e idh, responsables de las rutas biosintéticas de las aflatoxinas, OTA y patulina, respectivamente, fueron los más adecuados para la detección de cepas micotoxigénicas pertenecientes a los diversos géneros de mohos incluidos en este estudio. Tras la purificación y secuenciación de los productos de PCR amplificados resultantes con los métodos de PCR ensayados, se encontraron secuencias a partir de las cuales se diseñaron cebadores específicos y métodos de PCR convencional. Finalmente, se detectaron amplicones de 381 pb, 520 y 496 pb correspondientes a cepas productoras de aflatoxinas, OTA y patulina en especies toxigénicas de diversos géneros, mediante los métodos de PCR optimizados con los cebadores AFF1/AFR3, F1OT/R1OT y FC2/IDH2, respectivamente.
Los métodos de PCR desarrollaros demostraron ser sensibles y específicos capaces de detectar concentraciones de ADN de cepas productoras de aflatoxinas, OTA y patulina por debajo de 15 pg, 25 ng y 0.5 ng, respectivamente. Igualmente, la especificidad de estos métodos fue demostrada al detectar pequeñas concentraciones de las cepas productoras aún en presencia de elevadas concentraciones de cepas no toxigénicas, aunque como era de esperar, la intensidad del producto de PCR amplificado era ligeramente menor, posiblemente por competición del ADN inespecífico. Además, a diferencia de otros trabajos que alcanzaron valores próximos de sensibilidad, con los métodos de PCR diseñados en este trabajo, se pudo detectar diferentes géneros y especies de mohos toxigénicos empleando para ello una única pareja de cebadores y un protocolo de PCR.
Los protocolos de PCR diseñados fueron también ensayados empleando ADN de mohos toxigénicos artificialmente inoculados en alimentos, alcanzándose límites de detección de 102-104 ufc/g. Esto demuestra la importancia y sensibilidad de los métodos de PCR elaborados, ya que se alcanzaron valores de sensibilidad iguales o menores que los descritos por otros autores para la detección de una especie determinada y con previa incubación de la muestra. Sin embargo, los métodos diseñados en este estudio, detectaron hasta niveles bajos de contaminación por mohos toxigénicos, en una amplia variedad de alimentos, sin necesidad de incubación previa de las muestras y detectando especies toxigénicas pertenecientes a diversos géneros de mohos.
Por último, se llevaron a cabo ensayos de inhibición por parte de los componentes propios de las matrices alimentarias, demostrando que aquellos alimentos que poseían mayor contenido graso, proteico y de polifenoles, mostraron inhibición al realizar las PCR en presencia de elevadas cantidades de ADN de alimento no inoculados, ya que estos componentes afectan a la calidad de extracción del ADN y, consecuentemente, a la amplificación de la PCR.
Para evitar la necesidad de aplicar un protocolo de PCR convencional para la detección de mohos productores de cada una de las micotoxinas, se desarrolló un método de PCR múltiple en el que, combinando tres parejas de cebadores diseñados basados en los genes omt-1, otanpsPN e idh en una misma reacción y protocolo de PCR múltiple, se lograron amplificar tres bandas simultáneamente correspondientes a la producción de aflatoxinas, OTA y patulina, alcanzándose límites de detección del orden de 1 ng al emplear ADN genómico y de 103-105 ufc/g al usar ADN de las tres especies de mohos micotoxigénicas extraídas de los alimentos contaminados. La importancia de este método recae en que ningún método de PCR múltiple descrito ha sido capaz de detectar las principales especies productoras de aflatoxinas, OTA y patulina al mismo tiempo, detectándose diferentes géneros y especies con un único set de cebadores y un único protocolo de PCR.
En conclusión, los métodos de PCR simples y múltiple desarrollados, debido a su rapidez, sensibilidad y especificidad demostrada, deberían ser considerados como herramientas útiles a acoplar a los rutinarios sistemas de APPCC de las industrias alimentarias, con el fin de asegurar la calidad de los alimentos y, por tanto, la salud de los consumidores.
