Degradación de derivados cianurados y resistencia al cianuro de pseudomonas pseudoalcaligenes cect5344
- Autores: Felipe Acera Hernández
- Directores de la Tesis: Alberto Quesada Molina (dir. tes.), Rafael Blasco Pla (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Extremadura ( España ) en 2011
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco Castillo Rodríguez (presid.), Víctor M. Luque-Almagro (secret.), Fernando Rojo de Castro (voc.), Eduardo Díaz Fernández (voc.), María Isabel Igeño González (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
Pseudomonas pseudoalcaligenes es una bacteria alcalófila que resiste concentraciones de cianuro de hasta 30 mM y que crece utilizando este compuesto tóxico como única fuente de nitrógeno. Se ha descrito es esta bacteria un una agrupación génica en forma de operón donde se localizan los genes cio ("cyanide insensitive oxidase"), que codifican una oxidasa terminal insensible al cianuro. Estos genes se han mostrado esenciales para la resistencia al cianuro en P. pseudoalcaligenes ya que la inactivación de los genes cio mediante inserción por recombinación sencilla de un marcador de resistencia (gen aacC1 que confiere resistencia a kanamicina) retrasa el crecimiento en medios que contienen el tóxico. Por otro lado, P. pseudoalcaligenes se ha mostrado capaz de crecer con una amplia variedad de compuestos cianurados como fuente de nitrógeno, entre los que se encuentra la 3-cianoalanina, un conocido intermediario en la ruta de eliminación del cianuro en vegetales.
En este trabajo tesis se ha llevado cabo la mutagénesis dirigida mediante inserción del marcador aacC1 por doble recombinación en los genes que componen el operón cio. Se ha mutagenizado una posible nitrito/sulfito reductasa (gen sir/nir), que es el primer gen del operón; los genes cioA y cioB que dan lugar a oxidasa insensible al cianuro; un marco de lectura situado junto a cioB (denominado orf2); y una fosofoserina aminotransferasa (serC) que cierra la agrupación. Tanto la inactivación total del operón como de cualquiera de los genes cioA, cioB u orf2 sensibiliza a la bacteria frente al cianuro. Además, las medidas de respiración insensible al cuanuro (actividad NADH deshidrogenasa "in vitro") en extractos de membrana son significativamente inferiores en estos mutantes frente a la estirpe silvestre o la que expresa de manera constitutiva los genes cio (mutante polar en sir/nir). Esto experimentos implican que cioA y cioB forma parte de la oxidasa alternativa pero también orf2, por lo que proponemos su denominación como cioC. Además, la expresión de los tres genes tanto en cepas de Pseudonomonas putida como de E. coli les confiere resistencia a cianuro.
En este trabajo de tesis se ha purificado hasta homogeneidad electroforética una 3-cianoalanina nitrilasa altamente específica de su sustrato. Se ha demostrado que su expresión se induce únicamente en medio mínimo con cianuro como única fuente de nitrógeno, lo que sugiere su posible implicación en la asimilación del cianuro. La enzima presenta además un claro carácter asimilador al producir dos aminoácidos proteinogénicos a partir de 3-cianoalanina, aspartato y asparagina, previniendo la transformación en amonio de todo el nitrógeno del nitrilo. Sin embargo, un mutante dirigido en el gen que codifica la 3-cianoalanina nitrilasa sigue utilizando cianuro como única fuente de nitrógeno. Por contra, el mutante crece con 3-cianoalanina como fuente de nitrógeno de forma mucho más lenta que la estirpe silvestre, incluso en presencia de cianuro, que actúa como inductor de la expresión del gen..
Por último, en esta tesis se han realizado trabajos para la finalización del proyecto de secuenciación del genoma de P. pseudoalcaligenes CECT5344 consistente en el ordenamiento de las secuencias parciales obtenidas, tanto mediante la amplificación y secuenciación directa de los posibles huecos entre contingencias, como mediante el uso de programas bioinformáticos. El análisis y anotación del borrador genoma del que se dispone ha permitido que hayan sido encontrados dos operones cio adicionales y hasta nueve posible nitrilasas. Se han realizado análisis filogenéticos sobre estos genes y buscado secuencias de interés biotecnológico. Así se han detectado genes implicados en la resistencia a arsénico y mercurio y en la degradación de derivados bencénicos, atrazinas y otros compuestos contaminantes. También se han encontrado dos operones relacionados con la síntesis y degradación de bioplásticos (polihidroxibutiratos). Este conocimiento abre la posibilidad de nuevas aplicaciones biotecnológicas de Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344, aparte de la ya conocida de asimilar cianuro.
